2007 Fiscal Year Annual Research Report
進化分子工学と分子動力学計算の併用による脱水素酵素の機能改変
| Project/Area Number |
18580093
|
|---|
| Research Institution | Shimane University |
|---|
Principal Investigator |
澤 嘉弘 Shimane University, 生物資源科学部, 教授 (70127489)
|
|---|
| Keywords | グルタミン酸脱水素酵素 / アスパラギン酸脱水素酵素 / リンゴ酸脱水素酵素 / 分子動力学計算 / 進化分子工学 / MOE |
|---|
| Research Abstract |
1.我々は、Bacillus subtilis由来グルタミン酸脱水素酵素(BsGluDH)のG82KおよびM101S変異酵素が、オキサロ酢酸に対して高い活性を示すことを報告している。今年度は、すでに報告しているBsGluDH熱安定化変異酵素Q144Rとこれらの変異部位を組み合わせた、二重化変異酵素を作成して、その基質特異性を検討した。その結果、Q144R/G82KとQ144R/M101Sのオキサロ酢酸に対するKcat値は、1.99,2.14s^<-1>であり、単置換酵素より、いくぶん低下が認められたが、単置換酵素では見られなかったピルビン酸に対して高い活性(5.73and2.69s^<-1>)を示すようになった。
2.エラープローンPCRによるランダム変異法と大腸菌由来アスパラギン酸オキシダーゼと西洋ワサビベルオキシダーゼを組み合わせるL-アスパラギン酸発色スクリーニング系により、BsGluDH:Q144R/G82KおよびQ144R/M101Sのkcat値の上昇を試みているが、現在までにそのような変異酵素は得られていない。
3.同じく、ランダム変異法とL-アスパラギン酸発色系を用いて、昨年度得られた高いアスパラギン酸の酸化的脱アミノ活性を持つEcMDH:E215DおよびE215Rの還元的アミノ化反応を獲得した変異酵素をスクリーニングしているが、現在までにそのような酵素は得られていない。
4.ランダム変異法とアスパラギン酸発色法を用いて、常温で還元的アミノ活性を持つアーキア由来AfAspDHのスクリーニングを行った。現在までに、37℃で反応性を示す3種のクローンを単離したが、いずれも発現が上昇した株であり、反応至適温度は、野生型とまったく変わらなかった。
|
