抗体重鎖可変領域イディオトープライブラリーを用いた整列ペプチド配列解析法の確立

2007 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18580340
• Research Institution: Nagahama Institute of Bio-Science and Technology
• Principal Investigator: 西 義介 Nagahama Institute of Bio-Science and Technology, バイオサイエンス学部, 教授 (40387957)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 向井 秀仁 株式会社三菱化学生命科学研究所, 情報ペプチド工学研究, 主任研究員 (20251027)
• Keywords: バイオテクノロジー / プロテオーム / 分子進化工学 / 生体分子 / 抗体工学

Research Abstract

1)ライブラリーの作製:1-1)scFvライブラリー:8週齢のlpr/lprの雄の脾臓mRNAより、オリゴdTまたはランダムヘキサマーを用いてcDNAを調製した。H鎖及びκ鎖用縮重プライマーを用いて、scFvを増幅し、pCANTAB5-Eに組み込み、TG1に電気穿孔法により形質転換した。現在、総形質転換体数から推定されるライブラリーサイズは10^6個台である。NotIの切断活性が完全ではないために、スタッファー・インサートの混入を防ぐために、NotI部位をSfiI部位に変換したベクターを作製した。1-2)lprVHライブラリー:縮重プライマーの違いを除き、ほぼ同様な方法でライブラリー化した。20数回の形質転換で得られた総形質転換体数から推定されるライブラリーサイズは2x10^7個となり、当初の目標に達した。配列をシークエンスしたところ、調べた配列は全て、マウスVH鎖であることが分かった。但し、ほぼ半数にストップコドンが認められた。1-3)_lprVkライブラリー:lprVHライブラリーとほぼ同様な方法でライブラリー化した。現在、総形質転換体数数から推定されるライブラリーサイズは10^6個台である。1-4)IgNARライブラリー:昨年に引き続き、イヌザメ脾臓よりcDNAを調製し、ネコザメ抗体配列から設計した縮重プライマーを用いた結果、抗体遺伝子の増幅を認めた。これらの配列についてシークエンスしたところ、既報のサメに由来するIgNAR配列に属する配列であることが明らかとなった。10数回の形質転換で得られた総形質転換体数から推定されるライブラリーサイズは2x10^7個となり、当初の目標に達した。
2)大腸菌による抗体分子発現系の確立:タンパク質の発現系ベクターであるpET41を抗体分子発現、精製用のべクターに変換した。この系を用いて抗体分子を封入体から回収、再生することに成功した。