抗体重鎖可変領域イディオトープライブラリーを用いた整列ペプチド配列解析法の確立

2008 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18580340
• Research Institution: Nagahama Institute of Bio-Science and Technology
• Principal Investigator: 西 義介 Nagahama Institute of Bio-Science and Technology, バイオサイエンス学部, 教授 (40387957)
• Keywords: バイオテクノロジー / プロテオーム / 分子進化工学 / 生体分子 / 抗体工学

Research Abstract

1)ライブラリーの作製とパニング:1-1)H鎖ライブラリー:レパートリーサイズが2×107個からなるライブラリーが完成した。また、8週齢のBalb/cマウスの雌の脾臓mRNAより同様にH鎖イブラリーを調製した。こちらのレパートリーサイズも2×107個に達した。lpr/lpr由来のH鎖ライブライーを、1万倍以上スケールアップした後にヘルパーファージを感染させ、H鎖ディスプレイファージをレスキューした。これを、ポリエチレングリコールを用いて沈殿させ、リン酸バッファーに溶解して、19種類のトリペプチド(H-P-X:XはCを除く19種類)ビーズのミクスチャーに対してパニングした。パニングは5回行った。5回のパニングで濃縮が認められた。そこで、この19種類の中で最も、濃縮がかかったH-P-Rに対して、さらにパニングを5回行い、最終結合ファージをPCRにてインサート確認を行ったところ、複数ではあるが、結合抗体が得られた。1-2)サメのIgNAR抗体のライブラリーは2×107個のレパートリーサイズに達したが、配列を確認取ると、それぞれが極めて似ていることが分かった。そこで、サメ抗体のフレームを用いて、CDR領域の任意化を図った。サメにおいてはCDR(CDR1,CDR3)は2本であり、CDR3が最も長い。CDR3のシステイン2個を除く12箇所を任意化したプライマーを設計し、これを元にライブラリーを作製した。結果、108個のレ派トリーからなるライブラリーが作ることが出来た。これらの配列を確認したところCDR3領域の任意化はきちんと確認できた。1-3)抗体分子の発現の検討:サメ抗体をpET41系に組換え、BL21によるタンパク質発現を確認した。発現したサメ抗休は封入体画分に来ていることが確認できた。