2007 Fiscal Year Annual Research Report
スフィンゴミエリナーゼの触媒および基質認識機構の解明
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18590084
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| Research Institution | Osaka University of Pharmaceutical Sciences |
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Principal Investigator |
藤井 忍 Osaka University of Pharmaceutical Sciences, 薬学部, 講師 (80218966)
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| Keywords | スフィンゴミエリナーゼ / 触媒機構 / 基質認識 |
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| Research Abstract |
リン脂質加水分解酵素は酵素分子表面に存在する界面認識部位の作用により、基質がミセルを形成するとその活性は著しく高くなるが、スフィンゴミエリナーゼ(SMase)については明らかにされていない。そこで、アシル鎖長の異なるリゾレシチン(LysoPC)を用いてSMaseの酵素活性を測定した結果、いずれのLysoPCを用いても、その臨界ミセル濃度(cmc)の1/3付近の濃度でSMaseの酵素活性は急激に増大した。また, SMaseによって加水分解されないアシル鎖の短いレシチン(PC)は, SMaseが存在するとcmc以下の濃度で凝集することがわかった。さらに、SMaseとPCとの結合について表面プラズモン共鳴を用いて測定した結果, cmc前後のPC濃度において3つの異なるセンサーグラムが得られた。以上の結果から、SMase分子表面には界面認識部位が存在し、単分子分散状態の基質が一定濃度以上存在すると、その部位に基質が協同的に集合し、酵素の高次構造の変化を誘発することにより酵素活性を増大させることが示唆された。また、この協同的な相互作用は、コリン基を持つ界面活性剤、Mn^<2+>、またはCa^<2+>の存在によって、さらに低い基質濃度で見られることも明らかになった。他方、哺乳類由来中性Mg^<2+>依存性SMaseについては、大腸菌による大量発現系の構築を試みたが、発現量が少なかった。そこで、膜結合ドメインを欠損させた変異体の発現を試みた結果、多量に発現することが確認できたが、不溶性画分に発現した。現在、発現タンパク質の再構成方法の検討を行いっており、今後、再構成した酵素を用いて酵素反応速度論に基づく実験や結晶化を行う予定である。
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Research Products
(1 results)
