2006 Fiscal Year Annual Research Report
生活関連化学物質の皮膚感作性等のインビトロ評価法に関する研究
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18590132
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
内野 正 国立医薬品食品衛生研究所, 環境衛生化学部, 研究員 (40232863)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹澤 俊明 独立行政法人農業生物資源研究所, 遺伝子組換え家畜研究センター, 研究員 (50301297)
五十嵐 良明 国立医薬品食品衛生研究所, 環境衛生化学部, 研究員 (60176071)
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| Keywords | レギュラトリーサイエンス / 組織培養工学 / 3次元培養ヒト皮膚モデル / 皮膚感作性 / インビトロ評価法 / 樹状細胞 / CD86 / ケラチノサイト |
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| Research Abstract |
研究代表者においては正常ヒト皮膚繊維芽細胞(NHSF)を研究分担者(竹澤)から供給されたコラーゲンビトリゲル薄膜の一方の側に播種し、2時間培養後、コラーゲンビトリゲル薄膜を反転させてアッセイリングの上に乗せ、もう一方にコラーゲングルと混合した正常ヒト樹状細胞(NHDC)を播種した後、その上に正常ヒト表皮角化細胞(NHEK(F))またはヒト類上皮癌細胞(A431)を培養した。48時間培養後、皮膚モデルの表面を空気に曝してケラチノサイトを分化させ、14日間培養して皮膚モデルを構築した。これを10%中性緩衝ホルマリンで固定して組織断面をHE染色及びCD86免疫染色を行い、皮膚モデル構築の確認を行った結果、従来のコラーゲングルを用いた3次元培養ヒト皮膚モデルに比べて7日間培養期間を短縮出来、かつNHSFの細胞数を4分の1にすることが出来た。UV照射(UVC,800mJ/cm^2)したコラーゲンビトリゲル薄膜を用いてNHSFの定着率を比較した結果、UV照射したものの方が有意に定着率が高く、皮膚モデルとして適切であることが明らかとなった。ケラチノサイトをNHEK(F)を用いたモデルとA431を用いたものの組織断面を比較した結果、正常ケラチノサイトを用いたものの方が角層が厚く、皮膚モデルとしてより適切であることが明らかとなった。皮膚感作性物質であるDNCBを1時間暴露したところ、2mMまでは顕著な細胞毒性を示さず、2mM添加時においてCD86発現が認められた。研究分担者(五十嵐)においては皮膚感作性についてin vitro試験法との比較のために、in vivo試験法のLocal Lymph Node Assay(LLNA)について、特にRIを用いないLLNAについて文献調査を行った。
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