2006 Fiscal Year Annual Research Report
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18590205
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
水上 洋一 山口大学, 総合科学実験センター, 助教授 (80274158)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
篠田 晃 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (40192108)
鈴木 春巳 国立国際医療研究センター(研究所), 臨床病理研究部, 部長 (70235985)
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| Keywords | GPR30 / KOマウス / エストロゲン / GPCR |
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| Research Abstract |
GPR30コンディショナルKOマウスの作製
I-1.LoxP配列を挿入したターゲッティグベクターの作製
GPR30はExon3のみから転写されていることから、Exon3のみをCreリコンビナーゼで切り出して欠損するコンディショナルマウスを作製する。実験にはKOマウスの作製に使用したターゲッティングベクター5領域の下流にLoxP、さらにGPR30のORFを挿入したのち、LoxP遺伝子を挿入する。独立して発現するネオマイシン耐性遺伝子を挿入した後、2.5kBの3'領域を挿入したターゲッティングベクターを作製する。これらの配列をシークエンスで確認した後に精製し、リニアライズした後、ES細胞への導入を行った。
I-2.ES細胞への導入とスクリーニング
ES細胞をマウス繊維芽細胞存在下で培養しエレクトロポレーションで電気刺激を行ったのちターゲッティグ遺伝子を導入する。遺伝子導入後、ES細胞を限界希釈し384マイクロブイレート上で培養しネオマイシンで選択を行う。選択後に増殖した細胞を一部保存し、残りの細胞からゲノムDNAを調製する。ネオマイシン耐性遺伝子の配列を指標に3種類の異なるタッチダウンPCRを行い、陽性の細胞を選別した後、PCR産物のダイレクトシークエンスを行い、配列を確認する。組換えが行われている細胞のみストックから起こし細胞培養する。
I1-3.C57/BL6マウスを用いたキメラマウスの作製
増殖したES細胞を熊本大学に依頼し、キメラマウスを作製している。
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Research Products
(3 results)
