2006 Fiscal Year Annual Research Report
未知のポリADP-リボシル化タンパク質の同定とその修飾部位の決定
| Project/Area Number |
18590277
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Research Institution | Nagahama Institute of Bio-Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
三輪 正直 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 教授 (20012750)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
亀村 和生 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 講師 (00399437)
|
|---|
| Keywords | 翻訳後修飾 / ポリADP-リボシル化 / ポリ(ADP-リボース)分解酵素 / ショウジョウバエ / ポリ(ADP-リボース)合成酵素 / 中心体 |
|---|
| Research Abstract |
ポリ(ADP-リボース)に対する抗体を用いて免疫沈降によりポリADP-リボシル化タンパク質の解析を行っている。その過程で、以前から我々が作成して使用してきたポリ(ADP-リボース)に対するモノクローン抗体10Hは、ウエスタンブロット、蛍光染色などには適しているが、ポリADP-リボシル化されたタンパク質を免疫沈降する際には、やや親和性が弱いことが示唆されるデータを得た。一方市販の抗体としての、ポリ(ADP-リボース)に対するウサギポリクローナル抗体は、少量で高価なため、ポリADP-リボシル化されているタンパク質を網羅的に単離するためには、経済的には不可能であると判断されたので、自家製のポリ(ADP-リボース)抗体をウサギを用いて作成した。
方法は、子牛胸腺の核画分を用いて、NAD+と反応させポリ(ADP-リボース)を生合成し、タンパク質のプロナーゼEよる分解、フェノール抽出、ずい臓DNase I,すい臓RNase, P1ヌクレアーゼによる核酸成分の消化、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーによりADP-リボース残基の鎖長が10-25を中心とするポリ(ADP-リボース)画分(画分II)を得た。ウサギの免疫には、ポリ(ADP-リボース)4mg、メチル化牛血清アルブミン3mgを混合し、フロイント完全アジュバントを加えて懸濁後、ウサギの皮下に注射し約1ヵ月後に抗体価が上昇したところで耳より採血した。
現在、この抗体を使用してショウジョウバエよりポリMP-リボシル化タンパク質を同定すべく進めている。
|
