2007 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子プロモーターメチル化細胞を可視化するin situ MSP法の開発
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18590330
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
河内 茂人 Yamaguchi University, 大学院・医学系研究科, 准教授 (80284511)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐々木 功典 山口大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (80116722)
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| Keywords | in situ MSP法 / エピジェネティクス / 遺伝子CpGメチル化 / in situ PCR法 |
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| Research Abstract |
エピジェネティクな遺伝子発現調節機構のひとつである遺伝子プロモーターCpG領域シトシンメチル化は、個体発生、発癌や疾愚罹患に関する個体差等の、医学上の多岐にわたる問題と密接に関連している。今回、われわれが科学研究費助成金の交付を受けた研究テーマは、「特定の遺伝子プロモーター領域にCpGメチル化を持つ個々の細胞を、組織切片上で標識可視化する技術(in situ MSP法)の開発」であった。当初、われわれの想定したin situ MSP法は、以下の行程で構成されるものであった。(1)固定薄切された組織切片あるいは塗抹細胞をスライドガラス上に貼付し、タンパク分解酵素による細胞核DNAの形骸化処理。(2)亜硫酸ナトリウムによるシトシン⇒ウラシル置換反応。(メチル化シトシンの場合は亜硫酸ナトリウムによる変化を受けない。)(3)亜硫酸ナトリウム処理済みの組織切片上で、通常の液相MSP法で使用するメチル化特異的および非メチル化特異的プライマーを用いて、標準的なin situ PCR間接法の手法に順じたDNAフラグメントの増幅、標識反応、CpGメチル化細胞同定の施行。平成18年度の助成期間中にin situ MSP法の開発を完了する予定であったが、当初の予想以上に非特異的標識がみられ改善の必要性があると考えられた。解決策として固定、蛋白分解酵素処理の改変、PCRプライマーの設計見直し、in situ PCR法の条件改良等を行った。以上の再検討の結果から非特異的標識の原因としては、(3)のin situ PCR法によるものが最も重要と考えられたので、平成19年ではin situ PCR法の条件を見直し、同年度半ばには基本的手技の確立を達成した。この成果は平成20年5月の日本病理学会総会で発表の予定である。また、確立したin situ MSP法の詳細は学術論文として執筆中である。手技の確立に当初の予想以上に時間と経費を要したin situ MSP法であるが、今後は本法の有用性を実際の研究に用いて実証する。
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