2007 Fiscal Year Annual Research Report
ミトコンドリア抗酸化タンパクのノックアウトがマラリア原虫の生育に及ぼす影響の解析
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18590412
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| Research Institution | Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine |
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Principal Investigator |
河津 信一郎 Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, 原虫病研究センター, 教授 (60312295)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
狩野 繁之 国立国際医療センター(研究所), 適正技術開発・移転研究部, 部長 (60233912)
鳥居 本美 愛媛大学, 医学部, 教授 (20164072)
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| Keywords | 感染症 / マラリア / ミトコンドリア / レドックス / 遺伝子改変原虫 |
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| Research Abstract |
昨年度、ミトコンドリアに局在する2-Cys型Prx(TPx-2)を欠損する熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)(TPx-2KO)を作製した。TPx-2KOは、通常のin vitro培養では親株と同様に増殖し、また、過酸化物(t-BOOH)あるいはNADH再酸化系末端酸化酵素(AOX)阻害剤の負荷についても、親株と同様の感受性を示した。そこで今年度は、in vivo環境において、TPx-2の欠損が原虫生理に与える影響を観察する目的で、TPx-2遺伝子を欠損するローデントマラリア原虫(P. berghei, ANKA strain)の作製を試みた。遺伝子欠損用ベクター(ノックアウトコンストラクト)の作製は、pMD204(マラリア研究標準試薬機構;MR4より領布)を用いておこなった。P. bergheiゲノムDNAを鋳型にしてTPx-2遺伝子5'/3'領域を増幅するため、データベース配列を基に制限酵素配列を付加したプライマーセットをデザインした。向プライマーセットで増幅した5'/3'断片をpMD204のdhfr-tsカセット(ピリメタミン耐性遺伝子)の、それぞれ、上流と下流に方向性を保ってクローニングした。次に、P. berghei TPx-2の抗血清を作製した。P. bergheiゲノムDNAからTPx-2翻訳領域をPCRで増幅して、大腸菌用発現プラスミドにクローニングして、GSTタグ付きタンパク質を作製した。発現タンパク質をGSHセルロースカラムで精製して、ウサギに免疫して、抗血清を作製した。現在TPx-2 KO原虫の作製をおこなっている。P. bergheiメロゾイトへの電気穿孔法によるノックアウトコンストラクトの導入後、薬剤マーカー(ピリメタミン)によるスクリーニングをおこない、限界希釈で得られたクローンについて、TPx-2遺伝子座での相同組換えをSouthern blotで、また、TPx-2 nullの表現型をWestern blotで碓認し、KO原虫の赤血球内発育型での増殖等について観察する予定である。
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