小児期の成長板における軟骨細胞の分化に及ぼす炎症性サイトカインの影響

2007 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18591197
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 森 雅亮 Yokohama City University, 医学研究科, 准教授 (30254204)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 横田 俊平 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (10158363) ; 今川 智之 横浜市立大学, 附属病院, 准教授 (20336548) ; 成戸 卓也 横浜市立大学, 医学研究科, 博士研究員 (60438124)
• Keywords: 成長板 / 軟骨細胞 / 炎症性サイトカイン

Research Abstract

「軟骨細胞の分裂・増殖・分化を方向付ける外的因子と受容体、細胞内シグナル機構、転写因子、産出される蛋白質などの同定を指標にして、各分化時期の細胞に炎症性サイトカイン(IL-1 β, IL-6, TNF α, IFN γ, IL-18)を加えその変化を観察し、炎症性サイトカインの成長阻害の機構を明らかにする」ことを目的として、以下の検討を行った。
軟骨細胞におけるサイトカイン誘導CRPの転写レベルでの発現機序の解析
軟骨細胞を用いて、IL-6, IL-1, TNF-α刺激によるCRPプロモーター活性を検討した。
・CRPプロモーター(-942/+1)ルシフェラーゼコンストラクトによるサイトカイン組合わせによる活性化の検討、すなわち細胞にルシフェラーゼコンストラクトをtransfectionさせ、各種サイトカイン及びその組み合わせによる刺激を与え、ルシフェラーゼ活性を測定しプロモーター活性を検討した。
・転写関与プロモーター領域をプローブとしてelectro mobility shift assay(EMSA)を行い刺激後における転写因子結合の有無を確認した。つづいてNF-κB p50, NF-κB p65, C/EBP β, STAT-3, c-jun, c-fos等に特異的抗体を用いたsuper shiftを行い、関与転写因子を同定することを試み、依然取り組んでいる。
・オリゴヌクレオタイドを導入させた細胞に予めプロモーター領域に関与する転写因子遺伝子(NF-κB, c/EBP β, c-fos, c-jun等)を組み込んだ発現ベクターによるプラスミドをcotransfectionさせ、サイトカイン刺激後のルシフェラーゼ活性を測定し、overexpressionによる転写因子の活性能を検討した。
以上の検討をもとに、平成20年度の本研究を現在実施している。