RNA干渉を用いた骨芽細胞、脂肪細胞分化調節因子の新規同定とその機能解析

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18591656
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 新井 嘉容 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (10401390)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹田 秀 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, COE拠点形成特任教員 (30376727) ; 麻生 義則 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 助手 (50345279) ; 若林 良明 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助手 (00431916)
• Keywords: スクリーニング / 非翻訳RNA / 骨芽細胞分化 / 脂肪細胞分化

Research Abstract

1 成熟細胞特異的遺伝子プロモーター制御下にチミジンキナーゼを恒常的に発現する細胞株の確立:
オステオカルシンプロモーターを用いて成熟骨芽細胞特異的にチミジンキナーゼを発現する(OSC-TK)C2C12細胞株を樹立した。また、脂肪細胞分化に伴いチミジンキナーゼを発現する(AP2-TK)3T3-L1細胞株も樹立した。それぞれ分化促進因子であるBMP-2あるいはインスリン等の添加により分化が誘導されること、ノザンブロットにてチミジンキナーゼの発現が誘導されることを確認した。さらに、ガンシクロビルの投与によりいずれの細胞も死滅した。こうしてスクリーニングの系を構築した。
2 未分化間葉系細胞由来siRNAライブラリーの構築:
未分化C2C12細胞および骨芽細胞へと分化したC2C12細胞より常法によりRNAを採取し、さらにcDNAライブラリーを調整し、レンチウィルスによるsiRNAライブラリーを構築した。またマウスゲノムを用いた別のsiRNAライブラリーを共同研究者とともに開発した。
3 siRNAライブラリーを用いたスクリーニング:
1で確立した細胞株に、2のライブラリーを感染させ、分化を誘導する条件の下で培養した。分化誘導によっても死滅しない細胞群、すなわちsiRNAにより分化誘導が障害された細胞をこれまでに数クローン単離した。現在、これらの細胞群よりDNAを得て、発現しているsiRNAの遺伝子同定を進めている。