2008 Fiscal Year Annual Research Report
破骨細胞応答性を調節する受容体安定性調節機構の解析
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18591675
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| Research Institution | Josai International University |
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Principal Investigator |
和田 誠基 Josai International University, 薬学部, 教授 (10301467)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
神谷 貞浩 城西国際大学, 薬学部, 助手 (10398555)
扶川 武志 城西国際大学, 薬学部, 助手 (00439019)
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| Keywords | 破骨細胞 / 脱感作 / 骨粗鬆症 / mRNA安定性 |
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| Research Abstract |
カルシトニン(CT)の持続的感作は骨の標的臓器である破骨細胞で不応性を誘導し、ホルモン作用の持続が障害される。我々の検討ではその機序としてCT受容体(CTR)mRNA安定性調節機構の関与が推測されている。mRNA半減期は3'非翻訳領域(UTR)のAU rich element(ARE)配列がcis elementとして働き、c-fosやGM-CSF、IL-3での報告と同様に安定性調節・半減期の調節に重要な役割を担っている。破骨細胞前駆細胞の蛋白を抽出したところCTR mRNA3'非翻訳領域(CTR 3'UTR)配列RNAプローブと結合性を持っ蛋白が確認された。結合蛋白の分子量は40-45kDaでAUF-1、HuR関与の可能性を検討した。HA-tag付加AUF1をNIH3T3細胞に導入し、抽出蛋白と3'UTR RNAを相互作用させたところ結合性が確認できた。抗HA抗体を利用した免疫沈降で蛋白RNA複合体を回収し、結合RNAをRT-PCR法で解析したところ、CTR 3'UTRに設定したプライマーで特異的に増幅された。RNA認識部位を変異させると3'UTR配列との結合性は見られず、蛋白RNA結合特性に依存していると思われた。CTR3'UTRにAUF1が結合することでのmRNA安定性への影響を検討するため、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を導入したベクターを構築した。Luc mRNA3'UTRに相当する領域にCTR 3'UTR断片を挿入した。MCF7細胞にこのベクター及び、CTR 3'UTR断片を挿入していないベクターを導入し24時間培養した。その後ドキシサイクリンを添加し転写を停止させ、Luc mRNA残存量をLuc活性で検討した。その結果、CTR 3'UTR断片を挿入するとmRNAの半減期が短縮することが明らかとなった。
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