2008 Fiscal Year Annual Research Report
RNAiを用いた軽度低温の脳浮腫抑制効果に果たす水チャンネル機能の解析
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18591714
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
藤田 義人 Nagoya City University, 大学院・医学研究科, 講師 (90238593)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
浅井 清文 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (70212462)
祖父江 和哉 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (90264738)
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| Keywords | 水チャンネル / ノックダウン / 脳浮腫 / 脳低温 / アクアポリン / RNAi |
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| Research Abstract |
今後の研究の基礎とるアクアポリン(AQP) Knockdown細胞株の確立を重点に行った。
Knockdownが確認されているconstructを作成したうえ、vectorに導入した。shRNAを発現するvectorには、神経系の細胞のRNAiで定評のあるinvitrogen社製のBlock-IT Pol II miR RNAi expression vector、 pcDNA 6.2-GW/miRを使用した。そのプラスミドを大腸菌にtransformationして、大量培養し、Quiagen社のキットを用いて、目的となるconstructを含むプラスミドを大量に、無菌的に精製した。
アストロサイトにtrasnfectionする方法として、リポフェクションを利用した、Trans-IT Neuralを使用した。ただ、transfectionをおこないRNAiのの効率が非常に悪く、10%以下となっている。このことに関して、transfection効率の最もよくなると考えられる条件を、mediumの組成や、transfection reagentの量、vectorの量などの最適条件を検討中した。ウエスタンでRNAiの効果を確認するが効果が弱く、原因が(1)transfectionの効率が悪い(2)実際のRNAiがうまくいっていないかはっきりわからなかった。そこで、その原因追求のため、transfection効率を視覚的に確認するためvecterにGFPをつけることを試みた。GFPをvectorに挿入した。そしてGFPをつけたvectorを大量制作した。
そのGFPつきのvectorの挿入で、視覚的におおざっぱにいって20%ぐらいのtransfection効率があることを確認した。ただRNAi効果をえる効率は、まだ10%程度にとどまった。transfection効率をあげるためレンチウイルスを使用したvectorの作製を進めると同時に、現在作成してあるGFPつきvectorを用い。実際の低温における脳浮腫効果の解明を始めている。
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