2006 Fiscal Year Annual Research Report
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18658031
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| Research Institution | Toyo University |
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Principal Investigator |
東端 啓貴 東洋大学, 生命科学部, 講師 (20344864)
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| Keywords | アーキア / tRNA / tRNA修飾酵素 |
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| Research Abstract |
アーキア由来の核酸関連酵素を大腸菌内で大量発現させた際、不溶性顆粒を形成してしまい、活性のある酵素を取得することが難しい場合が多々ある。そこで、種々のアーキア(Pyrococcus horikoshii, Thermoplasima acidophilum, Halobacterium sp.NRC1)由来のTGT及び候補遺伝子をターゲットにして発現用プラスミドを構築し、発現条件および精製方法の決定を試みた。3種類のアーキアをそれぞれ培養し得られた菌体から染色体DNAを抽出し、それを鋳型にしてPCRを行うことでそれぞれの遺伝子断片を取得した。遺伝子断片をlacプロモーターの支配下に発現できるようにpUC19へ組み込んだものと、高発現プラスミドであるpET-21aへ組込んだものを順次作製している。プラスミドの構築が完了したものについて発現条件を検討した。T.acidophilum由来TGT遺伝子をpET-21aへ組込んだプラスミドを大腸菌内で発現(37℃、1mM IPTG)させた場合、不溶性画分への発現が確認された。T.acidophilum由来候補遺伝子をpET-21aへ組込んだ場合は、可溶性画分への発現を確認できた。P.horikoshii由来TGT遺伝子をpET-21aへ組込んだ場合は、可溶性画分への発現を確認できたが、候補遺伝子は不溶性画分へ発現した。次に、その候補遺伝子をpUC19へ組み込み、大腸菌内での誘導を試みたがタンパク質の発現を確認できなかった。さらに、その候補遺伝子を、C末端側にヒスチジンタグを連結した融合タンパク質として発現させたところ、可溶性画分への発現を確認できた。可溶性画分への発現が確認されたタンパク質はすべて80℃、30分間の熱処理後の上清に存在していたことから、耐熱性を保持していると考えられた。
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