発癌予防のための形態形成シグナル系抑制ペプチドワクチンの開発

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18659372
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 中村 雅史 九州大学, 大学院医学研究院, 助教授 (30372741)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 片野 光男 九州大学, 大学院医学研究院, 教授 (10145203)
• Keywords: Hedgehog / Patched1 / 乳癌 / 膵癌 / 抗体 / 分子標的 / 抗体治療 / 細胞増殖

Research Abstract

Patched1蛋白上で、三次元構造上でリガンドとの結合部位にあたる領域における親水性・表面存在確率・抗原性・進化上の保存性が高い9アミノ酸配列を選び標的配列とし、二羽の家兎を用いて抗ペプチド抗体を作成した。免疫した家兎血清を用いて、抗血清のin vitroでの抗原認識性を検証した。Patched1蛋白を高発現していることが確認できている膵癌腫瘍細胞株を用いてウエスタンブロッチングを行った。免疫前血清ではシグナルが検出されなかったが、免疫後血清はPatched1蛋白に相当する160kD蛋白を認識した。さらに、5種類のPatched1高発現乳癌・膵癌細胞株を用いたウエスタンブロットでも、全ての細胞で共通する160kD蛋白を認識し、他の抗Patched抗体による認識バンドとも一致した。次に、培養細胞を固定後に本抗体を用いた間接蛍光染色を行い共焦点レーザー顕微鏡で観察した。細胞膜のみが鮮明に染色されてPatched1蛋白の分布に一致した。以上は、変性蛋白に対する認識能にあたる。実際にviable cellで増殖抑制作用を得るためには、変性していない蛋白の認識能を検証する必要がある。この目的で、培養中のviableな乳癌細胞の培養液に本血清を添加しincubation後、2次抗体を添加して蛍光観察を行った。本抗体は、変性していない蛋白で構成されるPatched1高発現なviable cellの膜蛋白を認識した。これに対し、コントロールのPatched1を発現していない大腸癌細胞は染色されなかった。以上、Hedgehogシグナル上の受容体であるPatched1蛋白に対するオリゴペプチド抗体の作成に成功し、natural及びdenatured両者の蛋白認識に成功した。今後、本抗体によるシグナル制御・腫瘍細胞増殖に対する効果を検証していく。