2006 Fiscal Year Annual Research Report
プロテオグリカンを用いた腫瘍マーカーおよび、血行転移阻害剤開発のための基礎研究
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18659391
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
竹之下 誠一 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (10167489)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹林 勇二 福島県立医科大学, 医学部, 講師 (70321982)
小野木 仁 福島県立医科大学, 医学部, 助手 (10381394)
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| Keywords | プロテオグリカン / 低酸素環境 / Hypoxia Inducible Factor / 糖鎖 |
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| Research Abstract |
研究計画(1)In vitroによるSnmdecan-4とα5-Integrinの転写活性の検討
大腸細胞株を低酸素培養することによりSyndecan-4,5-IntegrinのmRNA変化をRT-PCRしたところ低酸素培養株で有意に転写亢進がみられた。この変化は低酸素培養時間に依存的であり、我々の実験では24時間から36時間の低酸素培養でもっとも転写亢進がみられた。
他臓器の培養癌細胞株でも実験したが、胃癌細胞株で同様の傾向がみられることが確認された。
研究計画(2)ルシフェラーゼベクターの作製
Hypoxia Inducible Factor(HIF)が結合するHypoxia Responsive Element(HRE)をタンデムにつないだpGL2-Control Vectorを作製した。
同時にHREの上流-20baseからHREの下流+20baseにかけてpoint mutationを組み入れたvectorも作製した。これらのvectorを各種培養癌細胞にtransfectすることにより低酸素培養したときのHIFの作用を比較した。
上で作製したベクターを用いルシフェラーゼアッセイ解析を行った。96well plateに大腸癌細胞株、胃癌細胞株をそれぞれ3種類ずつを7日間低酸素培養し、通常酸素濃度で培養した癌細胞株と比較した。Dual Luciferase Assay System(Promega)を用い解析した結果、HREをタンデムにつないだvectorでは、そうでないものと比較すると転写活性が亢進していることが確認された。またHREにmutationがあるvectorでは転写亢進がなかったことから、Snmdecan-4とα5-Integrinの低酸素環境下での発現亢進にはHIFが関与していることが確認された。
研究計画(3)Flow-Cytometric Analysis
大腸癌細胞株、胃癌細胞株、乳癌細胞株3種類ずつを低酸素培養し、抗Snmdecan-4抗体とα5-Integrin抗体を用いて癌細胞表面に存在するSnmdecan-4とα5-Integrinを測定した。その結果、乳癌細胞株では有意な結果はみられなかったものの、大腸癌細胞株では低酸素培養細胞株では有意にこれらの発現上昇があることが確認された。
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