2006 Fiscal Year Annual Research Report
X型コラーゲンプロモーター解析による軟骨細胞肥大化の分子メカニズム
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18659435
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
竹下 克志 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (30262009)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鄭 雄一 東京大学, 大学院医学系研究科, 助教授 (30345053)
村上 元昭 東京大学, 医学部附属病院, 医員 (50396751)
中山 修一 東京大学, 医学部附属病院, 医員 (80401066)
原 慶宏 東京大学, 医学部附属病院, 医員 (00422296)
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| Keywords | シグナル伝達 / 再生医療 / 軟骨細胞 |
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| Research Abstract |
1)肥大分化を安定して再現するin vitroでの実験系の開発
マウステラトカルシノーマ由来の軟骨細胞前駆細胞株であるATDC5をインスリン刺激すると軟骨様細胞へ分化しII型コラーゲンなど軟骨特異的遺伝子を発現する。ここに、リン刺激を加えることで肥大軟骨細胞へと分化する系を確立した。これは肥大軟骨のマーカー遺伝子であるColXをはじめ、肥大軟骨に発現することが報告されているMMP-13、VEGF、Runx2、BMP6、ALP、PTH/PTHrP receptor、lhhなどの遺伝子のmRNAが誘導されることをreal time RT-PCRにより確認した。また、これらの細胞に対するvon Kossaや、Alizarin redなどの染色性が増すことでも肥大分化が進んでいることが確認された。
2)ヒトColXプロモーター領域のクローニングと基本転写活性の評価
肥大軟骨のマーカー遺伝子であるColXのプロモーター断片のクローニング及びその断片を組み込んだルシフェラーゼ・レポーターコンストラクトの作成をヒトゲノムDNAをPCRで増幅する方法で行い、このレポーター遺伝子を用いて基本転写活性の評価を行った。プロモーター断片としては、種間で比較的保存された転写開始点より上流4.5kbの配列をクローニングした。アッセイ法としては、1)で確立した肥大分化する系の細胞や肥大分化とは無関係の細胞(Hela細胞やHuH7細胞)にレポーターコンストラクトをトランスフェクション試薬を用いて遺伝子導入し、その基本転写活性をルミノメーターで測定した。その結果、転写開始点より上流約80bp付近に転写活性が上昇するシスエレメントの候補となる領域を同定した。
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