2006 Fiscal Year Annual Research Report
intact OHCを用いたsiRNAによる至適prestin発現密度の直接解析
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18659494
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
新川 秀一 弘前大学, 医学部, 教授 (90125584)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
欠畑 誠治 弘前大学, 医学部, 助教授 (90261619)
丸屋 信一郎 弘前大学, 医学部附属病院, 助手 (90396408)
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| Keywords | 内耳外有毛細胞 / 蝸牛増幅機構 / パッチクランプ法 / prestin / siRNA |
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| Research Abstract |
目的:
内耳再生医療のメインターゲットは最も受傷性の高いOHC運動能の回復である。再生機構として、支持細胞のOHCへの分化転換やOHCの自己修復が想定されている。近年、内耳の分化誘導に関与している遺伝子であるAtoh1の内耳内の導入により支持細胞から"有毛細胞様細胞"への分化転換の可能性が報告され、運動能の回復による聴力の回復が示唆されている。
しかし、"蝸牛増幅機構"回復のためのprestinの至適発現量はわかっていない。すなわち、聴力回復のためにどの程度のOHCの運動能の回復が必要なのか決定する必要がある。
結果:
1.Prestin高発現OHCの作成
C57BL/6マウスより得られた器官培養コルチ器内の外有毛細胞(OHC)、支持細胞であるダイテルス細胞に、マイクロバブル(診断用超音波造影剤)を併用してソノポレーション法にてprestin遺伝子(Pres)を内耳に導入した。生後5日目(P5)から生後18日目(P18)までのC57BL/6Jマウスを用いた。prestin遺伝子とマイクロバブルを混和した後、混和した細胞外液に蝸牛を入れ超音波を照射した。
2.prestin遺伝子の導入の確認
発現ベクターにGFP遺伝子を挿入しGFPによる蛍光シグナルを確認するとともに、培養コルチ器組織よりRNAを抽出し、gerbilのprestin遺伝子配列に特異的なオリゴプライマーを用い、reverse transcription-PCRによってprestin遺伝子の導入を確認した。
3.パッチクランプ法によるPrestin高発現OHCの機能的解析
コルチ器より細胞を単離し、パッチクランプ法にてprestin遺伝子導入細胞(prestin高発現OHC)の運動能解析を試みているが、現時点でまだ成功していない。
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