2007 Fiscal Year Annual Research Report
頭頚部癌細胞由来RNAAヘリカーゼのクローニングと機能解析
| Project/Area Number |
18659609
|
|---|
| Research Institution | Matsumoto Dental University |
|---|
Principal Investigator |
山岡 稔 Matsumoto Dental University, 歯学部, 教授 (50064671)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上松 隆司 松本歯科大学, 大学院・歯学独立研究科, 准教授 (40203476)
堂東 亮輔 松本歯科大学, 歯学部, 助教 (40329470)
内橋 隆行 松本歯科大学, 歯学部, 助教 (70397628)
楢本 浩子 松本歯科大学, 歯学部, 助教 (30410426)
寺本 祐二 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (80460442)
|
|---|
| Keywords | 頭頸部癌 / ヘリカーゼ / 遺伝子 / クローニング |
|---|
| Research Abstract |
ヘリカーゼは、mRNAの巻き戻し(unwinding)を行う細胞増殖に必要な酵素で、癌細胞では蛋白合成や浸潤、転移に影響を与えると考えられる。癌細胞のRNAの巻き戻し作用とその後に生じる蛋白合成を抑制する阻害剤を開発すれば、新しい癌治療法が開発される。そこで、以下の手順で口腔扁平上皮癌細胞に由来するRNAヘリカーゼについて、1、頭頸部癌細胞由来のRNAヘリカーゼのDNA断片の単離、2、完全長cDNAをクローニング、3、抗体の作製、4、ライブラリーの作製、5、癌細胞由来ヘリカーゼ蛋白発現細胞の検討を行った。まず、頭頸部癌細胞(HSG)を無血清培養し、細胞抽出液および培養上清を回収した。その培養上清は、セントリコンプラス20で濃縮し、ゲル濾過カラム、イオン交換クロマトグラフィー、レクチンカラム、アフィニティカラムを用いてFPLCで最終分画した。精製蛋白は、フロイントアジュバントを用いてSPFウサギに免疫し、ヒトRNAヘリカーゼに対する抗血清を得た。抗体の有用性を抗原を試料としたウエスタンブロット法で確認したところ、約48kDaの蛋白バンドを得た。RNAヘリカーゼ活性の高い頭頸部癌培養細胞と正常細胞(ケラチノサイトまたは線維芽細胞)からAGPC法でtotal RNAを抽出し、オリゴdTカラムでmRNAを抽出した。微量核酸測定用分光光度計で260nm/280nmでmRNAを定量後、純度を確認してcDNAを合成した。UNIZAPIIファージベクターにスブクローニング後、in vivo excisionによりファージミドライブラリーとした。このファージライブラリーから抗体陽性プラークを採取した。このプラークより得たファージミドを用いて形質転換させた細胞では、細胞増殖と蛋白合成能が亢進することが明らかとなった。
|
