種特異的選択的プロモーターの体系的解析による転写制御配列要素形成機構の解明

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18681029
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 鈴木 穣 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 助教授 (40323646)
• Keywords: プロモーター / 分子進化 / 種特異性 / 転写活性化能 / 実験的検証

Research Abstract

申請者の予備的解析から、ヒト-マウス間での配列比較により対応するゲノム配列は存在するものの近傍に転写開始点データがマウス側にのみ存在しないものが約1000種類同定されている。本研究課題においては、初年度、当面の解析対象として選別した約100個のヒト種特異的選択的プロモーター候補と対応するマウスゲノム配列に対して、プライマーを設計し、それぞれのゲノムDNAをPCRにより増幅、クローニングを行った。クローニングは、汎用クローニングシステムGatewayを用いて96穴プレートにて行い、得られるクローンは両端からのシークエンス確認の後、将来の多目的的利用を見込んでグリセロールストックの遺伝子資源として保存した。単離された物理的クローンを用いて、ルシフェラーゼレポーターアッセイによる転写活性化能の測定を行い、転写活性化能がヒトプロモーター、対応するマウスゲノム間でどの程度異なるかについて定量的な解析を行う。細胞環境あるいは転写因子側の種間変化の影響を極力排除すべく、活性測定には汎用的培養細胞系としてヒト293細胞、およびマウスNIH3T3細胞を用いた。その結果、少なくとも約10種類のプロモーターについては、ヒトとマウスの間で顕著に転写活性化能の違いを示し、これらがヒト特異的プロモーターであることが実験的に検証できた。現在、これらのプロモータークローンに対して、上流、下流からをそれぞれ段階的にヒト/マウスゲノムに置き換えていったハイブリッドクローンを作成し、同様の転写活性化能の測定を行っている。また中立進化説に基づいてランダムに塩基置換を導入したときに、どの程度の活性変化が引き起こされるかも同時に検証している。次年度以降、転写活性可能と塩基置換位置の相関関係を検証することにより、転写活性化の獲得に本質的変異部位の同定を行う。