2007 Fiscal Year Annual Research Report
組換え大腸菌を利用するシトクロムP450システムの機能強化
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18686067
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
神谷 典穂 Kyushu University, 大学院・工学研究院, 准教授 (50302766)
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| Keywords | 生体触媒 / バイオ酸化プロセス / P450 / 細胞触媒 / 組換え大腸菌 / 補酵素再生系 |
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| Research Abstract |
近年、生体触媒の酸化反応プロセスへの応用が注目されている。酸化反応には一般に高温・高圧が要求され、反応の制御が困難であると同時に爆発性を伴うため、これを常温・常圧で効率よく行うことが可能なバイオプロセスに変換する意義は極めて大きい。本研究では、Pseudomonas putida由来の可溶性タンパク質からなるP450システム(以下、P450camシステム)をモデルとして、大腸菌を細胞触媒として用いる超高効率なバイオ酸化プロセスの構築について検討している。本年度は、P450camシステムの触媒反応プロセスに必須の3つのタンパク質成分のうち、補酵素NADHから供給される電子を媒介するプチダレドキシン(Pdx)と酵素部位であるP450camを遺伝子工学的手法により融合化することによりP450camシステムの触媒効率の向上を試みた。その結果、融合タンパク質が宿主内で部分的にプロテアーゼ分解を受けながらも、グリセロールデヒドロゲナーゼの共役無しに酸化反応が進行することが明らかとなり、融合タンパク質として宿主内でタンパク質発現を行うことによる局所濃度の向上が、タンパク質間相互作用を必要とする酵素触媒プロセスの触媒効率の向上に有効なことが分かった。さらに、酵素部位の部位特異的置換により、大腸菌内で色素(インディゴ)生産が可能なことが明らかとなった。また、非共有結合的相互作用に基づく機能強化については、鋳型となるタンパク質との融合タンパク質発現ベクターを数種類構築し、大腸菌内での発現を試みたが、何れも現時点ではP450活性を確認できていない。一方、触媒反応プロセスにNADPHが必要なBacillus megaterium由来のP450-BM3については、発色基質の合成を行い、分光学的な活性の追跡が可能な系の構築を完了した。
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