2006 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子導入を用いた精子形成の試みと男子不妊症臨床応用に向けた基礎的研究
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18689039
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
小島 祥敬 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 助手 (60305539)
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| Keywords | 男子不妊症 / 転写因子 / DAX-1 / 遺伝子導入 |
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| Research Abstract |
1.Ad4BP/SF-1およびDax-1cDNA遺伝子作製
(1)全長Dax-1cDNAの作製
マウス胎仔精巣よりmRNAを抽出し、オリゴ(dT)プライマー、ランダムプライマーによって逆転写反応を行いcDNAを合成。5'、3'プライマーを作製した後、cDNAを鋳型にPCRを行い、Ad4BP/SF-1およびDax-1遺伝子の全長を増幅した。得られたcDNAをプラスミドベクターに組み込み、大腸菌にトランスフォーメーション。増やして回収後、挿入断片の一部をシークエンスした後配列情報と比較して一致するかを確認した。
(2)組み換えアデノウイルスの作製
COS-TPC法を利用した組換えアデノウィルス作製キットAdenovirus Expression Vector Kit(TaKaRa Code 6150)を用いてアデノウイルスベクターを作成した。
2.培養細胞へのDAX-1遺伝子導入
(1)マウスセルトリ細胞およびライディッヒ細胞の初代培養
8-10週齢のICRマウスにブズルファンを投与し、完全に精母細胞、精子細胞、精子を精巣から除去した後セルトリ細胞とライディッヒ細胞を抽出した。
(2)培養細胞下での精巣細胞への遺伝子導入
精子形成細胞と、セルトリ細胞とライディッヒ細胞を共培養し(1)カチオニックリポフェクション法、(2)アデノウイルスベクター法を用いて、DAX-1の遺伝子導入を行った。DAX-1の発現をRTPCRと免疫組織化学染色、ウエスタンブロッティング法により確認した。発現場所はセルトリ細胞とライディッヒ細胞であった。
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