酵母を用いたL-アラビノースからエタノールへの高効率変換系の確立

2007 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18760592
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 渡邉 誠也 Kyoto University, エネルギー理工学研究所, 研究員 (90379032)
• Keywords: バイオマス / エタノール / サッカロミセス酵母 / L-アラビノース / 生物発酵

Research Abstract

本年度はまず、昨年度に同定した新規L-アラビノース代謝経路に含まれる酵素のL-KDA脱水酵素(AraD)のユニークな反応機構を解明する目的で立体構造解析を開始した。具体的には、大腸菌で発現させた組み換え酵素を用いて結晶化を行った。その結果、50mM Tris-HC1 pH7.5,0.4M NH_4H_2PO_4,5%(v/v)2-propanolの条件で良好な結晶を得ることができた。X線回折データ収集は、兵庫県西播磨にある放射光施設Spring8で行った。最終的に2Å分解能のネイティブ酵素の立体構造解析に成功した。引き続いて、反応阻害物質であるピルビン酸との複合体結晶構造解析に着手し、同様に構造決定に成功した。5つのL-アラビノース代謝遺伝子を酵母発現用ベクターに組み込み、酵母細胞内での発現の有無を調査した。その結果、いくつかの遺伝子が酵母内では発現しないことが明らかとなり来年度の研究計画の見直しを行った。具体的には、L-アラビノース代謝経路とEntner-Doudoroff経路やリン酸化を伴わないEntner-Doudoroff経路等の他の糖代謝経路との進化学的相関の知見をさらに発展させ、ピキア酵母の有する未解明のL-ラムノース代謝経路に関わっていると思われる遺伝子クラスターの同定に成功した。本発見は学術的に極めて興味深いものであるので引き続き研究を進めていくことにした。

Research Products

• [Journal Article] Thermostabilization of Pichia stipitis xylitol dehydrogenase by mutation of structural zinc binding loop. (2007)
  • Author(s): Annaluru, N., Watanabe, S., Pack, S. P., Saleh, A. A., Kodaki, T., and Makino, K.
  • Journal Title: Journal of Biotechnology 129(4) Pages: 717-722
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The Positive effect of the decreased NADPH-preferring activity of xylose reductase from Pichia stipitis on the ethanol production using xylose-fermenting recombinant Saccharomyces cerevisiae. (2007)
  • Author(s): Watanabe, S., Pack, S. P., Saleh, A. A., Pack, S. P., Annaluru, N., Kodaki, T. and Makino, K.
  • Journal Title: Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 71(5) Pages: 1365-1369
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Protein engineering of xylose reductase from Pichia stipitis for improved NADH-specificity and the efficient ethanol production from xylose in recombinant Saccharomyces cerevisiae. (2007)
  • Author(s): Watanabe, S., Saleh, A. A, Pack, S. P., Annaluru, N., Kodaki, T. and Makino, K.
  • Journal Title: Microbiology 153(9) Pages: 3045-3055
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Ethanol production from xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiae expressing protein engineered NADP^+-dependent xylitol dehydrogenase. (2007)
  • Author(s): Watanabe, S., Saleh, A. A., Pack, S. P., Annaluru, N., Kodaki, T. and Makino, K.
  • Journal Title: Journal of Biotechnology 130(3) Pages: 316-319
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Preliminary crystallographic analysis of L-2-keto-3-deoxyarabonate dehydratase involved in an alternative bacterial pathway of L-arabinose metabolism. (2007)
  • Author(s): Shimada, N., Mikami, B., Watanabe, S., Makino, K.
  • Journal Title: Acta Crystallographica F63(5) Pages: 393-395
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] タンパク質工学によるキシロース発酵酵母作出の新戦略 (2007)
  • Author(s): 渡邉誠也、牧野圭祐
  • Journal Title: バイオサイエンスとインダストリー 65(12) Pages: 18-20
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 微生物の糖代謝経路に見られる新規な進化学的関係 (2007)
  • Author(s): 渡邉誠也、牧野圭祐
  • Journal Title: 生化学 79(11) Pages: 1059-1064
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 細菌由来の新規なL-アラビノース代謝経路 (2008)
  • Author(s): 渡邉誠也、牧野圭祐
  • Organizer: 分子生物学会 第7回春季シンポジウム
  • Place of Presentation: 淡路島
  • Year and Date: 20080422-24
• [Presentation] 新規アラビノース代謝経路に関与するL-2-ケト-3-デオキシアラボネート脱水酵素の結晶構造解析 (2007)
  • Author(s): 嶋田直子、三上文三、渡邉誠也、小瀧努、牧野圭祐
  • Organizer: 第30回日本分子生物学会年会・第80回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 20071211-15
• [Presentation] 新規アラビノース代謝経路に関与するL-2-ケト-3-デオキシアラボネート脱水酵素の結晶構造解析 (2007)
  • Author(s): 嶋田直子、三上文三、渡邉誠也、小瀧努、牧野圭祐
  • Organizer: 日本結晶学会2007年度年会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 20071201-02
• [Presentation] 脱水素酵素の補酵素特異性改変と安定化戦略 (2007)
  • Author(s): 渡邉誠也、小瀧努、牧野圭祐
  • Organizer: 酵素化学ミニシンポジウム
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 20071201-02
• [Presentation] 改変型酵素を導入した酵母によるキシロースからのエタノール生産 (2007)
  • Author(s): 松鹿昭則、渡邉誠也、小瀧努、牧野圭祐、井上宏之、村上克治、澤山茂樹
  • Organizer: 第59回日本生物工学会大会
  • Place of Presentation: 広島
  • Year and Date: 20070925-27
• [Presentation] Highly Efficient Bioethanol Fermentation from Woody Biomass (2007)
  • Author(s): Watanabe, S., Kodaki, T. and Makino, K.
  • Organizer: Core university program joint seminar between Seoul national university and Kyoto university〜Research and development for environmentally clean renewable energy production system〜
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2007-07-20
• [Presentation] 酵母の糖代謝経路の新展開〜バイオエタノール生産への活用から新規代謝経路の発見まで〜 (2007)
  • Author(s): 渡邉誠也
  • Organizer: 第10回真核微生物交流会
  • Place of Presentation: 広島
  • Year and Date: 2007-06-22