シロイヌナズナSGS3の生化学的解析及びその遺伝子ファミリーの機能解析

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18770042
• Research Institution: National Institute of Agrobiological Sciences
• Principal Investigator: 吉川 学 独立行政法人農業生物資源研究所, 植物科学研究領域植物・微生物相互作用研究ユニット, 主任研究員 (80391564)
• Keywords: ta-siRNA / サイレンシング / ウィルス

Research Abstract

1.SGS3の生化学的解析
trans-acting siRNA (ta-siRNA)の生成に機能するSGS3の生化学的な機能解析を行うために、His-tagを付加したタンパク質を大腸菌で発現した。この際、通常の培養条件では可溶性が低かったため、条件検討を行い、可溶性を上昇させることに成功した。その条件下で大量発現を行い、アフィニティーカラムやゲルろ過カラムなどを使って高純度に精製した。ta-siRNAの生成過程で生じる中間体と考えられる断片をT7のRNAポリメラーゼのプロモーター配列に連結してクローニングし、in vitro転写を行い、基質として調製した。His-tag融合タンパク質とこの基質RNAとの結合を用いてゲルシフトアッセイ行ったが、結合活性は認められなかった。部位特異的変異体やN端、C末端欠失変異体を導入した形質転換体を作製し、F2種子が得られた。それぞれのタンパク質の発現量や安定性を検出するためにペプチド抗体を作製し、35Sのプロモーターを用いた野生型SGS3タンパク質の形質転換体を使ってウェスタンブロット出を行ったところ、形質転換体特異的なバンドが予想されるサイズに検出できた。
2.SGS3相同遺伝子の逆遺伝学的解析
SGS3に相同性のある6個の遺伝子の-DNA挿入変異体を請求し、それぞれについてホモ系統を得た。しかし、目的の遺伝子の発現があまり抑制されていない変異体があった。また、相同性の高い遺伝子間の二重変異体を作製した。