2006 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノム解析によるカンキツグリーニング病原細菌と宿主相互作用の解明
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18780033
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| Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
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Principal Investigator |
宮田 伸一 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 果樹研究所カンキツグリーニング病研究チーム, 主任研究員 (00313015)
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| Keywords | カンキツグリーニング病 / 罹病ニチニチソウ / ランダムクローニング |
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| Research Abstract |
まずCG病を罹病させたニチニチソウの主脈を用いて、Ca.L.asiaticusの濃縮画分を精製し、DNA抽出を行った。精製度を高めた結果、精製画分DNAの収量が非常に少なかったため、φ29ファージ由来のDNAポリメラーゼを用いたゲノムDNA増幅キットによってゲノムDNAの増幅を試みた。
その後、増幅ゲノムDNAを物理的に小フラグメントに物理的に勇断し、プラスミドベクターにショットガンクローニングして塩基配列決定を行った。
最初に、第1段階スクリーニング用としてM13(-20)およびM13R,T3,T7のユニバーサルプライマーを用いて、各クローンの端読みのみ行った。このときABI 3130xlを用いため、一週間でおよそ96サンプルが処理でき、合計で約500クローンを処理した。その後、GenBankなど既存のデータベースを用いてBLAST検索等を行い、遺伝子コード領域の機能推定を行って、α-プロテオバクテリア由来の配列に分類されるクローンを選抜した。この第1段階スクリーニングの結果、約5%程度の陽性クローン候補がセンバツできた。これらの陽性クローンの端部配列に特異的なプライマーを設計し、PCRによる第2段階スクリーニングを行って、第2次スクリーニングとした。陽性クローンについては全塩基配列を改めて決定し、再度BLAST検索によってアノテーションを行ったところ、現時点で20程度の陽性クローンが確認された。
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Research Products
(1 results)
