ブタ回虫幼虫における糖鎖合成関連遺伝子の網羅的クローニングと機能解析

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18790296
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 平田 晴之 東京大学, 大学院医学系研究科, 助手 (70381077)
• Keywords: 寄生虫病学 / 糖鎖 / 分子生物学 / データベース / 幼虫移行症

Research Abstract

研究実績の概要
ブタ回虫幼虫の糖鎖合成関連遺伝子の網羅的クローニングと塩基配列の解読
1.ブタ回虫幼虫の拾得と保存
ブタ回虫(成虫)の子宮から幼虫包蔵卵を採取し保存すると共に、幼虫を取り出した。
取りだした幼虫はRNA抽出液にいれて-80℃で保存した。
2.ブタ回虫幼虫糖鎖合成関連遺伝子の検索とクローニング
(1)ブタ回虫EST(Expressed Sequence Tag)データベースを用いた糖鎖合成関連候補遺伝子の検索
ブタ回虫ESTデータベースを用いて、既にクローニングされ、配列の明らかにされている線虫(C.elegans)など糖鎖合成関連遺伝子との配列相同性に基づいて検索した。
(2)ブタ回虫幼虫糖鎖合成関連候補遺伝子群のクローニングと塩基配列の解読
相同性の高い遺伝子を糖鎖合成関連候補遺伝子群として網羅的に検索し、RT-PCR法によりクローニングを行った。
3.ブタ回虫幼虫に特異的な糖鎖合成関連遺伝子の検索
(1)ブタ回虫幼虫感染幼虫移行症モデル動物の作製と抗血清(ポリクローナル抗体)の回収
ブタ回虫幼虫(5,000隻/1羽)を経口的にウサギに感染させ、酵素免疫測定法によって幼虫移行症ウサギモデルを作製したことを確認後、抗血清を約400ml回収、分注し-20℃で保存した。
(2)ブタ回虫幼虫感染幼虫移行症モデルマウスのモノクローナル抗体(MAb)の作製
ブタ回虫幼虫包蔵卵をBALB/cマウスに経口投与によりそれぞれ感染させ、ブタ回虫幼虫感染幼虫移行症モデルマウスを作製した(1,000個/1匹)。3回感染させたあとブタ回虫幼虫特異抗原を認識するMAbを産生するハイブリドーマを作製した。
(3)ブタ回虫幼虫cDNAライブラリーの構築
ブタ回虫幼虫から全mRNAを抽出し、これを鋳型としてcDNAを合成し、ファージベクターに挿入することによりcDNAライブラリーを作製した。