肝再生不全新規治療法の開発を目指した肝発生分子基盤の解析

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18790753
• Research Institution: Research Institute, Osaka Medical Center for Maternal and Child Health
• Principal Investigator: 近藤 宏樹 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪府立母子保健総合医療センター(研究所), 環境影響部門, 主任研究員 (10373515)
• Keywords: 肝発生 / 器官培養 / Hnf4α / 肝細胞 / SSH

Research Abstract

マウス発生初期肝臓に発現する遺伝子のスクリーニングを行うため、まず肝臓が発生して1日目の胎生9.5日胚から月刊蔵を単離し、器官培養することに成功した。この器官培養系を用いて、摘出した胎仔肝にアデノウイルス遺伝子発現システムにて培養肝臓の細胞内にHnf4αを強制的に発現させて細胞内遺伝子を撹乱し、対照として同じくLacZを導入して24時間器官培養後、mRNAを抽出した。このmRNAを鋳型としてcDNA合成を行い、この2つのcDNAに対し、suppression subtractive hybridization(SSH)を行い、得られたPCR産物をTAクローニングした。各クローンをシークエンスし、遺伝子を同定した。SSHの実施に当たりHnf4αの過剰発現で発現が増加したものをスクリーニングするforward subtractionと減少したものをスクリーニングするreverse subtractionの両方を行った。その結果、forward subtractionにて643個、reverse subtractionにて409個のクローンについて同定した。そのうち3クローン以上で発現の増加あるいは減少が確認された遺伝子がforward subtractionで33個、reverse subtractionで19個同定された。同定された遺伝子の中には、アミノ酸トランスポーターや蛋白修飾因子、クロマチン構成因子が存在した。これを一次スクリーニングとし、二次スクリーニングでは、胎生9.5日から成体までの肝臓におけるその遺伝子発現の推移についてRT-PCRを実施し、またE9.5日胚のin situ hybridizationを実施し発現分布を確認した。