2006 Fiscal Year Annual Research Report
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18791184
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
南場 淳司 弘前大学, 医学部附属病院, 助手 (50361027)
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| Keywords | KCNJ10 / 超音波 / マイクロバブル / 遺伝子導入 / 内耳血管条 |
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| Research Abstract |
初年度は培養内耳血管条への遺伝子導入を行い、その遺伝子導入法を確立することを目的として研究を進めた。当初はKCNJ10のプラスミドベクターを作成する予定であったが、その部分は次年度で行うこととし、gerbil prestin遺伝子ベクターを用いてin vitroで導入方法の検討を行った。
1.遺伝子導入
プラスミドベクターをマイクロバブルに封入し、マウスから摘出したコルチ器をマイクロバブル入りの培養液へ移した。そこへ超音波発生装置であるSonitron 2000(Rich Mar, Inora, OK, USA)から超音波を照射し、遺伝子を導入した。照射した組織は培養液中で24〜72時間CO2インキュベーター内で培養した。
2.導入遺伝子の確認
GFPを添加したプラスミドを導入したサンプルは蛍光顕微鏡下でGFPの蛍光シグナルを確認したが、細胞質、核にGFPの蛍光シグナルが認められた。遺伝子導入の確認のため、遺伝子導入したコルチ器組織からRNAを抽出し、特異的プライマーを用いてreverse transcription-PCRを行った。controlとしてマウス脳組織、遺伝子導入していないコルチ器、プラスミドDNAを用いた。結果は遺伝子導入したコルチ器から採取したcDNAとプラスミドDNAのバンドが一致し、脳組織、照射していないコルチ器からはバンドは認められなかった。これにより遺伝子導入が確認された。
3.発現量の調整
生理食塩水15μlとマイクロバブル10μlを混合する。
超音波は0.5Wで30sec照射し、duty cycleは10%で行うことで、発現量が最適化された。
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