口腔由来癌細胞でのFas誘導アポトーシス経路におけるHSP90の作用様式の検索

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18791373
• Research Institution: Iwate Medical University
• Principal Investigator: 高橋 典子 岩手医科大学, 歯学部, 助手 (60405777)
• Keywords: アポトーシス / HSP90 / ゲルダナマイシン / Fas / シグナル伝達 / 口腔腫瘍細胞

Research Abstract

Fas誘導アポトーシスシグナル伝達系へのHSP90の関与について検討するために実施したHSP90の阻害系ならびに過剰発現系の実験結果を以下に示す。
1.HSP90の阻害系として、HSG細胞をゲルダナマイシン(GDM)で処理しHSP90の機能を阻害したところ、Fas誘導アポトーシスの増強が認められた。一方、GDM処理により経時的にHSP90タンパク質の増加が認められた。
2.HSP90の過剰発現系として、HSG細胞にRecombinant HSP90タンパク質を導入した。Control(Mock)に対しHSP90導入細胞で、GDM、抗Fas抗体(CH-11)それぞれの単独処理ならびに両者処理の全ての場合において細胞死誘導の有意な抑制が認められた。
1,2の結果からHSG細胞におけるFas誘導アポトーシスシグナル伝達に対し、HSP90がそのターゲット分子を介して抗アポトーシスに作用し、GDMはこのHSP90の抗アポトーシス効果を解除することでアポトーシスを誘導することが示唆された。また、1でみられたHSP90阻害によるHSP90タンパク質の増加については、HSP90の代償的誘導が惹起されているものと思われた。
HSG細胞においてHSP90と相互作用する分子を免疫沈降-ウェスタンブロット法で検索した結果、Fasシグナル経路の制御に関与するFADD-like ICE inhibitory protein(FLIP)が検出された。また、GDMによりHSP90を阻害したところ、mRNAレベルでのFLIPの発現減少が認められた。これらのことから、FLIPがHSP90のターゲットタンパク質であると考えられる。
そこで、FLIPがHSP90のターゲットタンパクであることを証明するため、C末端にV5タグの融合したFLIPL, S, Rアイソフォーム発現ベクター(pcDNA-FLIPL, S, R-V5)を構築した。現在これらのベクターとN末端にFlagタグの融合したHSP90発現ベクター(pFLAG-CMV-1-HSP90)をHEK293細胞に導入してタンパク質を発現させ、V5、Flagで免疫沈降を行いそれぞれの免疫複合体についてV5、Flag抗体でウェスタンブロットを行いHSP90とFLIPの結合について検討中である。