顎顔面領域軟骨欠損に対する新規軟骨再生法に関する研究

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18791479
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 山田 陽子 東京大学, 医学部附属病院, 医員 (70420205)
• Keywords: Co12 GFPシステム / 新規軟骨形成誘導剤 / スクリーニング / Sox5,Sox6,Sox9 / 永久軟骨再生

Research Abstract

軟骨細胞分化をGFP蛍光を指標にリアルタイムで簡便かつ非侵襲的にモニタリングし、大量スクリーニングをより簡便にするために軟骨細胞特異的に発現する2型コラーゲンプロモーター断片(Col2)の下流にクラゲの発光蛋白(GFP)遺伝子を組み込んだ合成遺伝子を作製し、軟骨前駆細胞株であるATDC5細胞にこの遺伝子をstableに導入し、Col2GFP ATDC5細胞株を樹立した。確認として、分離した細胞株に軟骨分化を誘導するインシュリンを投与すると48時間以内にGFP蛍光蛋白発現が蛍光顕微鏡下にて確認できた。さらに軟骨特異的遺伝子(2型コラーゲン、アグリカン、コンドロモジュリン-1など)の発現と軟骨基質の合成と蛍光との相関も確認できた。そこで、樹立したCol2GFP ATDC5細胞株を96穴プレートに播種し、ライブラリーである既存の天然及び合成低分子化合物をそれぞれ添加し、スクリーニングを行った。培養後、短時間でGFPを発現したもののmRNAを回収し、リアルタイムPCR法で軟骨分化マーカーである2型コラーゲンやアグリカン、肥大分化マーカーである10型コラーゲンを解析し、基質合成能をトルイジンブルー・アルシアンブルー染色で評価した。その結果、合成低分子化合物のなかでチエノインダゾール誘導体(TM:分子量約500)が48時間以内にGFPを発現し、2型コラーゲンmRNAを12時間で発現上昇させた。さらに未分化問葉系細胞であるC3H10T1/2細胞に対しても軟骨分化を誘導し、軟骨基質を増加させた。TMは軟骨分化を強く誘導するが、軟骨肥大分化に対しては誘導しないことがわかった。そこでTMはどのシグナルを介して軟骨分化を誘導するか解析するためにマイクロアレイを行った。TM48時間処理(C3H10T1/2細胞)のマイクロアレイの結果、軟骨内骨化に重要な遺伝子に着目して列挙するとRunxファミリーではRunx1、SoxファミリーではSox5とSox6の顕著な発現上昇がみられた。今後はRunx1の軟骨分化作用、Runx1とSox5,6,9の相互作用を解析し、永久軟骨再生に必要なシグナルの探索を行っていく予定である。