犬におけるストレス・腫瘍診断マーカーとしてのクロモグラニンAに関する研究

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18880023
• Research Institution: Osaka Prefecture University
• Principal Investigator: 秋吉 秀保 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 助手 (50420740)
• Keywords: ストレス / 腫瘍 / 犬 / クロモグラニンA / バイオマーカー

Research Abstract

最初に犬CgAの分子生物学的特性を明らかとするため、犬副腎組織より、total RNAを抽出後、cDNAを作成した。これを基に犬CgA cDNAをクローニングし、その塩基配列(開始コドンを含む1293bp)を解析した(DDBJ accession No.AB201291)。塩基配列をもとに推測されたアミノ酸配列(407残基)をすでに報告されている他の動物種(人、牛、馬)と比較したところN末端領域(1-77)並びにC末端領域(314-407)において保存性が高い事が確認された。
次に、犬CgAに反応性の高い抗体の作成を試みた。過去に報告されている方法を参考に,採材した副腎組織をホモジナイズ後,熱処理を加え,イオン交換クロマトグラフィおよびゲル濾過クロマトグラフィなどを用いて,イヌCgA蛋白を,分離・精製し、精製後の蛋白質は,既存の抗ヒトCgA抗体を用いたWestern Blotting法およびN末端アミノ酸配列解析により,イヌCgAである事を確認後,抗体作成のための抗原としウサギに免役する事により抗イヌCgAポリクローナル抗体を作製した。同時に同定したイヌCgAアミノ酸配列より抗原性の高いと予測される部位を選択しペプチドを合成し,キャリアー蛋白と結合後,ウサギに免役する事により抗CgAペプチド抗体を作製した。作成した抗犬CgAペプチド抗体ならびに抗イヌCgAポリクローナル抗体は犬CgAに対して抗人CgA抗体よりも高い反応性を持つことが確認された。
作成した抗体の中で最もイヌCgAに対して反応性の高かった抗イヌCgAポリクローナル抗体を用いて犬血中CgA濃度測定のためのサンドイッチELISA系を確立した。