血液細胞でのRunx1/AML1による転写制御ネットワークの解明

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18890057
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 中川 正宏 東京大学, 医学部附属病院, 医員 (10431850)
• Keywords: シグナル伝達 / 癌 / マイクロアレイ

Research Abstract

Runx1は正常造血幹細胞及び白血病幹細胞の活性に非常に重要な役割を果たしていると考えられている.
今回,Runx1の造血幹細胞の制御機構の解明のため,Runx1の標的遺伝子ネットワークの解明を試みた.
我々が以前作成した,Runx1のコンディショナルノックアウトマウス(cKO)を利用して,トランスクリプトームの解析を行った.cKOマウスは,Creリコンビナーゼ活性依存性に遺伝子を欠失する.Creにエストロゲン受容体(ER)を融合させたCre-ERはタモキシフェン存在下でのみCre活性が発揮される.通常のタモキシフェンでは細胞毒性が問題となったため,ヒドロキシタモキシフェン(4-OHT)を用いた.まず,cKOマウスから骨髄細胞を抽出し,フローサイトメトリーを用いて,未分化造血細胞分画(KSL)を純化した各種サイトカイン存在下で培養し,レトロウィルスによりCre-ERおよびGFPを発現させ,再びGFP陽性の細胞集団を純化して培養し,4-OHT投与後経時的に細胞を回収し,RNAを抽出した.KSL細胞は非常に少数の細胞集団であり,レトロウィルスの導入も行うため,得られたRNAは非常に微量であった.効率の良いRNA増幅を検討し,増幅を行った上でcDNAマイクロアレイ解析を試みた.
通常の,生体で欠失させたcKOマウスと野生型マウスとの比較では,遺伝子欠失から時間が経過しており,比較対象の集団の変化が問題となる.今回,均質な細胞集団に対し,よく同期させた遺伝子欠失直後からのトランスクリプトーム解析を行い,標的遺伝子ネットワークの解明を試みた.