2006 Fiscal Year Annual Research Report
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18890198
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| Research Institution | Tokyo Dental College |
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Principal Investigator |
佐々木 穂高 東京歯科大学, 歯学部, 研究助手 (50433959)
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| Keywords | Aldhla2 / 歯髄 / 発生 |
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| Research Abstract |
1.局在の検索
ICRマウス(5週例)下顎切歯を含む顎骨を、タングステンナイフを用い川本法にて凍結非脱灰標本を作製した。一次抗体;Anti-Aldhla2 goat polyclonal antibody(Santa Cruz)1:50、二次抗体;Alexa488標識anti-goat IgG(Molecular Probe)1:100にて免疫蛍光染色を行い、万能写真顕微鏡(UPM)にて観察した。発現は、歯胚側末端部の歯髄に限局して認められ、歯髄の分化に伴い減少し、象牙芽細胞への分化や硬組織形成以前に消失していった。
2.発現の定量的検索
下顎切歯より採取した歯髄を未分化側より(1)歯胚側(2)中間側(3)切端側と分割し、定量的リアルタイムPCR法とWestern Blotting法を用いて経時的な定量的発現変化を検索した。定量的リアルタイムPCR法は、Trizolを用いてtotalRNAを採取しTaqman^【○!R】probe(Aldhla2;mOO50136)、内因性コントロールにGAPDHを用いてABI Prism7700にて行った。ΔCT法解析により切端側を基準=1とした場合、歯胚側は中間側の約30倍の発現を示した。Western Blotting法は、一次抗体;Anti-Aldhla2 antibody 1:100、二次抗体;Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulin/HRC(DAKO)1:100を私用した。発現バンドは、歯胚側から徐々に減少し切端側では消失した。
3.歯髄細胞の培養
下顎切歯より採取した歯髄組織を30mm dishに播種しα-MEMにて培養した。14日間培養したものを4%パラホルムアルデヒドにて5分間浸漬固定し(1)の条件で免疫蛍光染色を行った。細胞増殖が強く密になっている部位では、細胞質内に強発現が認められた。
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