2019 Fiscal Year Annual Research Report

A novel approach using aptamers for histone code analysis

Research Project

Project/Area Number	18F18330
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	川村猛東京大学, アイソトープ総合センター, 准教授 (70306835)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	LEE SUJIN 東京大学, アイソトープ総合センター, 外国人特別研究員
Project Period (FY)	2018-10-12 – 2021-03-31
Keywords	DNAアプタマー / エピゲノム / ヒストン修飾 / SELEX / MALDI-MS / ISET / MIK-MS
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的はDNAアプタマーをベースとした、クロマチンアフィニティー精製法を用いた質量分析計でのヒストン翻訳後修飾解析法の開発である。遺伝子変異によらない遺伝子発現制御機構であるエピゲノム修飾は、DNAのメチル化とヒストンタンパク質の翻訳後修飾などで制御されている。本ヒストン修飾解析法により様々な疾患に関わるエピゲノム制御の解析に役立つ技術とする。まず、最初にヒストンH3の3カ所の異なる部位の修飾(H3K4Me3, H3K9Me3, and H3K27Me3)を標的のヒストン修飾として選択した。これは遺伝子発現制御に重要と知られており、かつ比較的豊富に存在する修飾であるからである。これらについてアプタマースクリーニングをおこなった。アプタマーセレクションはランダムDNAライブラリーとヒストン修飾ペプチドを結合した磁気ビーズを使ってSELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)法でおこなった。これにより標的修飾を認識する複数のアプタマーを得た。昨年度までに得られたこれらのヒストン翻訳後修飾を認識するアプタマーについて親和性と特異性の解析をMIK-MS（Molecular Interaction Kinetics Mass Spectrometry)法にておこなった。さらにH3K4Me3について表面プラズモン共鳴法で詳細な解析で詳細な解析をおこない結合の確認をした。現在アフィニティー精製とMALDI-TOF MSによるISET(integrated selective enrichment target)プラットフォームでの解析法を確立を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 理由申請時に挙げたヒストンH3のリジン27番目のトリメチル化修飾(H3K27me3)を標的としたアプタマーの他にH3K27me3と同様に転写抑制に働くH3K9me3と遺伝子のプロモーター領域に存在するH3K4Me3を標的として選択し、 1stスクリーニングラウンド、カウンターセレクションラウンドで高特異性のアプタマーを選択した。最終的なDNAプールについて次世代シーケンサ(NGS)による解析をおこない複数のアプタマーを得た。途中で分担研究者が産休のため研究が中断したが、3標的のスクリーニングを終え配列決定、特異性の評価まで進み、一つの標的については最終目標であるISETプレートを用いたシステム構築の準備中であるのでおおむね順調と判断した。
Strategy for Future Research Activity	当初、標的としたヒストンH3の３種の修飾についてSELEX法とMIK-MS法による候補アプタマーを得ている。これらの内からまずH3K4Me3を標的として研究分担者が以前からおこなっている独創的な固相抽出法であるISET(integrated selective enrichment target)プレートを用いた検出法に適用する。この手法が構築されれば、特異的な修飾を持つクロマチンのアフィニティー精製(ChAP: chromatin affinity-precipitation)がおこなえる。ISETプレートで濃縮された特異的な修飾をもつヒストンは質量分析計(MS)で解析できる。MALDI-TOF MSを用いれば直接解析が可能であり、回収することによってLC-MSによって詳細な解析も可能であると考える。今後の方針として予定通り、この新規ChAP-MS解析法の確立を目指す。H3K4Me3での解析法が確立した後残りの2修飾についてもISETプレートを用いた検出系を完成させる予定である。