2019 Fiscal Year Annual Research Report
Development and biological application of photoreversible protein labeling technology
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18F18340
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
水上 進 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (30420433)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
SARKAR HIMADRI 東北大学, 多元物質科学研究所, 外国人特別研究員
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| Project Period (FY) |
2018-11-09 – 2021-03-31
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| Keywords | 蛋白質ラベル化 / eDHFR / フォトスイッチ化合物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
メトトレキセート（MTX）はジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）の競合阻害剤として知られており、抗がん剤やタンパク質ラベル化リガンドとして利用されている。本研究では、生体機能の可逆的な光制御を達成するために、リガンドの着脱が光制御可能なタンパク質ラベル化技術の開発を目指して研究を行っている。前年度までに、MTXの構造中の いくつかの原子を置換した光応答性MTX誘導体（azoMTX）を開発し、その機能評価を行ってきた。本年度は、より優れた光応答性リガンド―タグ蛋白質ペアを見出すために、MTX-eDHFRの結晶構造に基づいて、リガンド認識に重要な幾つかのアミノ酸をピックアップしたeDHFR変異体を作製し、光照射によって相互変換が可能なE体とZ体の双方のazoMTXの幾何異性体に対するそれぞれの親和性をしらべた。その結果、変異導入によっては、光照射によってより結合親和性の差が大きい変異体が見いだされた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
蛋白質構造データバンク（PDB)に収蔵されているeDHFRとMTXの複合体の結晶構造を基に、リガンド認識に関与しているアミノ酸をいくつかピックアップし、azoMTXのE体との結合に重要なアミノ酸のうちの幾つかを変異させた変異型DHFRのプラスミドを構築し、大腸菌で発現、蛋白質を精製した。この変異DHFRを用いてazoMTXの光照射/非照射下での親和性の変化を蛍光変更を用いて測定した。その結果、野生型eDFHRと比較して、よりZ型eDHFRに対して選択性の高い変異eDHFRが見いだされた。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き異なる変異eDHFRを作製する。また、リガンドへの置換基導入も行い、このようなタグ蛋白質への変異導入とリガンドへの化学修飾の両方を用いた研究戦略により光スイッチ可能なタグ蛋白質とリガンドペアの最適化を行う。
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