Molecular Design of Streptavidin Mutant with specificity for artificial biotin derivatives

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18F18765
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 井上 豪 大阪大学, 薬学研究科, 教授 (20263204)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): LI CONG 大阪大学, 薬学研究科, 外国人特別研究員
• Project Period (FY): 2018-11-09 – 2021-03-31
• Keywords: ストレプトアビジン / ペプチド複合体 / Ⅹ線結晶構造解析 / 分子設計 / 精製システム / タグ

Outline of Annual Research Achievements

ビオチン-ストレプトアビジンは生物界で最も結合定数の高い組み合わせであり、この組み合わせを用いたStrept Tagとして知られている蛋白質の発現・精製システムが開発されている。８つのアミノ酸からなるタグペプチドを認識するストレプトアビジンを担持したビーズで目的タンパク質を高純度に精製することができるシステムである。
しかし、生体内にはビオチンがビタミンとして存在しており、ビタミンが存在する系では精製システムも不活化され、ビーズに担持したストレプトアビジンが機能を失うケースが想定され、天然型ビオチンに干渉されない新規なタグ精製システムの構築を目指す。
本研究を推進するには、まず8つのアミノ酸からなるタグペプチドと野生型ストレプトアビジンの複合体のⅩ線結晶構造解析から開始する必要があり、その複合体構造を基にペプチドに対する親和性を維持したまま、ビオチンには干渉しない新たな変異体ストレプトアビジンの分子設計を行うことを具体的な目的としている。
これまでに野生型ストレプトアビジンのアポ型蛋白質の精製を行い、ペプチドとの結晶化を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

野生型ストレプトアビジンとビオチンの結合定数は10のマイナス14乗から15乗モルのオーダーで、生物界における最強の結合定数を誇る。従って、野生型ストレプトアビジンについて大腸菌を用いて大量に発現・精製しても、大腸菌由来のビオチン化蛋白質が複合体を形成し、アポ型の蛋白質を精製するのは大変に困難である。特に、蛋白質科学を未修得の研究員に指導しながら研究を進めるのは時間がかかるが、先ずはその精製から行い、既にこれに成功し、結晶化のステップに進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

本申請研究を推進するためにはまず複合体のⅩ線結晶構造を基に分子設計を行う必要がある。そのため、当面は複合体のⅩ線結晶構造解析のためのアポ型ストレプトアビジンとTagペプチドとの複合体の結晶化に注力する必要があると認識している。
これに成功すればクライオプロテクタントの探索、極低温下でのⅩ線回折実験および大型放射光実験実験施設でのⅩ線回折強度データの収集を行って、複合体のⅩ線構造を解析する予定である。複合体の構造が得られたら、その構造を基にビオチンには干渉しない変異体を設計することを予定している。