2018 Fiscal Year Annual Research Report
Comprehensive studies of working mechanism of Cas proteins using HS-AFM
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18H01836
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
柴田 幹大 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 准教授 (80631027)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | １分子イメージング・ナノ計測 / タンパク質・酵素化学 / ゲノム工学 / １分子計測・操作 / バイオイメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、様々なゲノム編集ツール, Casタンパク質に高速原子間力顕微鏡（高速AFM）を適用し、Casタンパク質が機能する姿を１分子イメージングすることで、その分子作動メカニズムを統一的に理解することが目的である。我々は最近、Casタンパク質の中で最も研究の進んでいるCRISPR-Cas9に高速AFMを適用し、Cas9が標的DNAを探索・結合・切断する一連の過程を１分子動画撮影することに成功した。この研究成果を基盤とし、様々な種に由来する多様なCasタンパク質、および、その巨大複合体に対し高速AFMを適用し、DNA切断ドメインの揺らぎ・構造変化・物性を網羅的に解析する。初年度は、研究の効率化を目的に、高速AFMを新たに設置した。既存の高速AFMと比べ、マイクロメーターヘッドの操作性、スキャナーの安定性を改善した。この高速AFMを用い、Staphylococcus aureusに由来するSaCas９、および、Cas12aに対して高速AFM観察を行った。Cas12aはCas9と異なりTTTN配列を認識し、また、切断されたDNAは5’突出末端となるため、ゲノム編集において、遺伝子を挿入する際に有利であると考えられている。さらに、Cas12aにおいては、Acidaminococcus sp. 由来のAsCas12aとLachnospiraceae bacterium 由来のLbCas12aを観察対象とし、Cas12aにおける共通の分子作動機構の解明を試みた。しかしながら、SpCas9で得られた高速AFM観察条件をそのまま各タンパク質の高速AFM観察に転用したが、DNA切断の過程を直接観察するには至らなかった。これらの結果は、各タンパク質において、最適な高速AFM観察条件が異なることを意味しており、次年度からはAFM基板の検討、観察バッファーの検討を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
SaCas9とAsCas12a, LbCas12aに対する高速AFM観察より、Casタンパク質単体では、安定な立体構造を形成せず、フレキシブルな動態をとることが分かった。さらに、Casタンパク質内部にRNAが結合すると、全てのCasタンパク質において、安定な立体構造を形成することが分かった。この結果は、RNAを介するCasタンパク質の立体構造には、RNAが重要であることを意味し、共通の分子作動機構と考えられる。次に、SaCas9のRNA-DNA三者複合体では、DNA切断ドメインがAFM基板側へ強く結合し、DNAを切断する瞬間を捉えるには至らなかった。その一方で、チューブ内において、DNA切断反応を開始させ、DNA切断後にもなお、DNAに結合しているかどうかを調べたところ、SpCas9はDNA切断後もDNAと強く結合するが、SaCas9の場合は、DNA切断後には、DNAから解離することが分かった。この結果は、SaCas9はSpCas9に比べ小型である点、タンパク質内部において、DNAと結合するサイトが少ないためだと考えられる。このDNA切断後に解離しやすいという点は、ゲノム編集において、新たな遺伝子を挿入する点で有利となる。
次に、AsCas12aにおけるRNA-DNA三者複合体では、標的配列DNAへの結合には、Mgイオンが必要であることが分かった。さらに、DNAに結合した際に、DNA切断ドメインがAFM基板側を向き、その動きが制限される様子が観察された。また、DNA切断反応後にはDNAへ結合したままの分子が多くみられ、タンパク質内部のDNA結合サイトの数がDNAとの結合を反映することが分かった。Cas12aにおける結果はSpCas9と同様であり、共通の分子機構と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、１年目に設置した高速AFMと既存の高速AFMの２台をフルに稼働し、SaCas9 および AsCas12aのDNA切断における構造変化の直接観察を試みる。１年目の結果を受けて、高速AFM基板の検討を行う。これまでは、DNAを固定するため、アミノシランを用いてマイカ基板表面を正電荷に修飾していたが、AFM基板がフラットであること、DNA切断ドメインが基板へ強く吸着することを考慮して、異なる手法でマイカ表面の修飾を試みる。これまでに、脂質二重膜を高速AFM基板に適用した実績があり、正電荷を含む脂質二重膜上に、DNAが吸着できることは分かっている。そこで、さらに詳細に脂質二重膜の組成を検討すること、および、高分子化合物をAFM基板に用いることで、DNAは基板に結合するが、Casタンパク質は吸着しない基板条件を探る。また、DNAへ巻き付いたCasタンパク質のDNA切断ドメインがAFM基板上でも自由に動けるようにするため、完全にフラットはAFM基板ではなく、数ナノメートルの隙間をもつAFM基板の開発にも取り組む。さらに、Cas12aタンパク質のDNA切断ドメインが基板へ吸着しないよう、システイン残基を導入し、マイカ上にタマビジンの２次元結晶を作り、ビオチン-アビジン結合による固定化も試みる。この場合、動くべきDNA切断ドメインはAFMの基板へは向かないため、その動きを阻害することはないと考えられる。こられのAFM基板の工夫をSaCas9にも適用し、DNA切断の瞬間を捉える。さらに、Cascade-Cas3とよばれる新たなCasタンパク質の試料調製を開始し、高速AFM観察が可能なほど純度の高い試料かの検討にも着手する。
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[Journal Article] Macrocyclic peptide-based inhibition and imaging of hepatocyte growth factor.2019
Author(s)
Katsuya Sakai, Toby Passioura, Hiroki Sato, Kenichiro Ito, Hiroki Furuhashi, Masataka Umitsu, Junichi Takagi, Yukinari Kato, Hidefumi Mukai, Shota Warashina, Maki Zouda, Yasuyoshi Watanabe, Seiji Yano, Mikihiro Shibata, Hiroaki Suga, and Kunio Matsumoto
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Journal Title
Nat. Chem. Biol.
Volume: 印刷中
Pages: 印刷中
Peer Reviewed
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