2020 Fiscal Year Annual Research Report
Comprehensive studies of working mechanism of Cas proteins using HS-AFM
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18H01836
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
柴田 幹大 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 教授 (80631027)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | １分子イメージング・ナノ計測 / ゲノム工学 / タンパク質・酵素化学 / １分子計測・操作 / バイオイメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ゲノム編集ツールCasタンパク質に高速原子間力顕微鏡（以下、高速AFM）を適用し、Casタンパク質1分子がDNAを切断する瞬間を実時空間で可視化し、その分子機能動画をライブラリー化することで、DNA切断分子作動メカニズムを統一的に理解することが目的である。最終年度は、１年目に設置した高速AFMと既存の高速AFMの２台をフルに稼働し、Staphylococcus aureusに由来するSaCas９、および、Acidaminococcus sp. 由来のAsCas12a、Lachnospiraceae bacterium 由来のLbCas12aに対して高速AFM観察を行った。その結果、核酸非結合状態ではフレキシブルな構造をとるが、RNA結合状態では安定で固い構造をとり、標的DNAに結合した状態では、RNA-Cas複合体はDNA上をスライドすることなく標的DNA配列に強固に結合する様子を捉えることができた。これらの実験結果は、SpCas9と比べて同様の分子動態を示しており、Casタンパク質群の共通の分子作動メカニズムと考えられる。さらに、所属研究所内の高分子を専門とする研究者と共同研究を開始し、Casタンパク質が機能できるAFM基板条件の検討を行った。具体的には、ピラーアレーンや人工ラセン高分子、PEGとPLLの混合高分子(METHOXY-POLY(ETHYLENE GLYCOL)-BLOCK-POLY)をAFM基板へ試し、PEGとPLLの混合高分子において、DNAは固定されるが、Casタンパク質の機能性ドメインの動きは制限されないことを見出し、AsCas12aにおいて、観察例は少ないながら、DNAを切断する瞬間を可視化することに成功した。最終年度ではあったが、Casタンパク質が機能できるAFM基板条件を見出すことができ、今後の研究の進展が期待できる結果を得た。
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| Research Progress Status |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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