2019 Fiscal Year Annual Research Report
High-speed AFM study on functional modulation of kinesin caused by structural defects of mictoruble
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18H01837
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
内橋 貴之 名古屋大学, 理学研究科, 教授 (30326300)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 高速原子間力顕微鏡 / 微小管 / キネシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
I. 高速力学マッピング法の開発1)
高速AFMでイメージング中に任意の位置での定量機械特性を取得可能な”in-line-force-curve”法を開発した。この手法を用いてチューブリンが重合したタンパク質ポリマーである微小管の単一チューブリンダイマーの引き抜きによる局所構造操作に成功し、チューブリンダイマー間の結合エネルギーの定量化を行った。さらに、”in-line-force-curve”を拡張し、機械特性(弾性率・凝着力)を1フレーム3秒程度でマッピングできるシステムを開発した。
II. 屈曲微小管におけるキネシンの滑走運動：マイカ基板にアイランド上に平面脂質膜を形成し、さらに脂質膜を構成する正電荷脂質の量を制御することで、微小管を屈曲して基板に固定することができた。この微小管上で微小管関連運動タンパク質であるキネシンの滑走運動を高速AFMで観察した結果、微小管の変形が細胞内輸送に関与するの滑走速度を制御していることが明らかになった。屈曲の曲率が異なる微小管でのキネシンの移動速度を解析したところ、曲率が大きくなるほどキネシンの運動速度が低下した。分子動力学シミュレーションでキネシンの運動速度低下の要因を探ったところ、変形した微小管ではキネシンの親和性が高まっているためであることがわかった。この結果は、キネシンの移動を制御するためのメカノセンサーとしての微小管の役割を明らかにし、微小管の機械的変形がキネシンの移動を制御する役割を果たしていることを示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
インラインフォースモードを利用した微小管への点欠陥の形成とサイズ制御は効率よく行えるようになった。しかしながら、現状では微小管に形成した点欠陥周辺のキネシンの運動を高解像かつ安定に観察するまでには至っていない。さらに微小管の固定方法およびAFMの観察条件の最適化を検討する必要がある。一方で、本研究課題で開発したインラインフォースモードを基盤として、さらに機能向上することで、生体試料の硬さや探針との凝着力といった力学・化学特性をマッピングできる機能を開発することができた。この機能を活かすことで、微小管の局所力学特性がキネシンの移動運動に与える影響も調べることができると考えている。また、本研究の過程で、微小管に構造欠陥を形成せずとも、微小管の屈曲がキネシンの運動速度が変調されることが明らかになった。これは、微小管を構成するチューブリンの構造が微小管の屈曲によりわずかに変化し、その構造変化によってキネシンとの親和性が変化していることを意味しており、実際、分子動力学シミュレーションで屈曲によるチューブリンの構造変化によって屈曲した微小管とキネシンの親和性が高くなり、その結果、キネシンの運動速が低下していることを明らかにすることができた。これらの結果を踏まえて、次年度は微小管の構造欠陥とキネシンの運動活性の計測および解析を進めていく。
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| Strategy for Future Research Activity |
インラインフォースカーブモードにより微小管に制御性良く欠陥を形成し、その欠陥周囲のでキネシンの運動解析を進める。具体的に以下の方法で実験を進める。
I. 微小管の局所ヌクレオチド状態の制御とキネシンの運動活性解析：微小管に生じた構造欠陥は周囲にあるフリーなチューブリンの結合により自己修復される。チューブリンはGTPの結合により重合するが、微小管中のチューブリンはGTP型とGDP型が混在した一種の状態欠陥を形成しており、それがキネシンの運動活性を変えるとの報告がある。微小管の自己修復機能を利用して、生成した欠陥にGDPあるいはGTP(GMPPCC)結合型のフリーなチューブリンで修復することで、微小管の局所的ヌクレオチド状態を制御する。アセチル化状態が異なるチューブリンでも同様の実験を行う。
２．微小管の局所欠陥によるキネシン-2の運動変調：モータータンパク質であるキネシン-2は微小管に欠陥があると速度の低下や微小管からの解離が起こることが報告されている。しかし、その際の欠陥とタンパク質の位置関係や速度低下の分子機構は明らかでない。前年度にチューブリンダイマー欠陥の数と位置を制御し、欠陥に遭遇したときのキネシンのふるまい、1) 欠陥からの距離と運動速度、2) プロトフィフィラメントの乗り換え運動、3) 欠陥のサイズに依存した運動速度低下と解離、4) 欠陥近傍でのキネシンの構造変化を解析し、構造・物性欠陥によるキネシンの運動変調の分子機構を明らかにする。
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[Journal Article] Supramolecular tholos-like architecture constituted by archaeal proteins without functional annotation.2020
Author(s)
Maho Yagi-Utsumi,Arunima Sikdar,Chihong Song,Jimin Park,Rintaro Inoue,Hiroki Watanabe,Raymond N Burton-Smith,Toshiya Kozai,Tatsuya Suzuki,Atsuji Kodama,Kentaro Ishii,Hirokazu Yagi,Tadashi Satoh,Susumu Uchiyama,Takayuki Uchihashi,Keehyoung Joo,Jooyoung Lee,Masaaki Sugiyama,Kazuyoshi Murata,Koichi Kato
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 10
Pages: 1540
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Mutational and Combinatorial Control of Self-Assembling and Disassembling of Human Proteasome ?? Subunits.2019
Author(s)
Taichiro Sekiguchi,Tadashi Satoh,Eiji Kurimoto,Chihong Song,Toshiya Kozai,Hiroki Watanabe,Kentaro Ishii,Hirokazu Yagi,Saeko Yanaka,Susumu Uchiyama,Takayuki Uchihashi,Kazuyoshi Murata,Koichi Kato
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Journal Title
International Journal of Molecular Sciences
Volume: 20
Pages: 2308
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] The Fab portion of immunoglobulin G contributes to its binding to Fc?? receptor III.2019
Author(s)
Rina Yogo,Yuki Yamaguchi,Hiroki Watanabe,Hirokazu Yagi,Tadashi Satoh,Mahito Nakanishi,Masayoshi Onitsuka,Takeshi Omasa,Mari Shimada,Takahiro Maruno,Tetsuo Torisu,Shio Watanabe,Daisuke Higo,Takayuki Uchihashi,Saeko Yanaka,Susumu Uchiyama,Koichi Kato
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 9
Pages: 11957
DOI
Open Access
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[Journal Article] On-Membrane Dynamic Interplay between Anti-GM1 IgG Antibodies and Complement Component C1q.2019
Author(s)
Saeko Yanaka,Rina Yogo,Hiroki Watanabe,Yuki Taniguchi,Tadashi Satoh,Naoko Komura,Hiromune Ando,Hirokazu Yagi,Nobuhiro Yuki,Takayuki Uchihashi,Koichi Kato
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Journal Title
International Journal of Molecular Sciences
Volume: 21
Pages: 147
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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