2019 Fiscal Year Annual Research Report
Next generation DNA sequencing using surface-enhanced Raman spectroscopy
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18H01847
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
菅野 公二 神戸大学, 工学研究科, 准教授 (20372568)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
磯野 吉正 神戸大学, 工学研究科, 教授 (20257819)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 表面増強ラマン分光 / 1分子計測 / DNAシーケンシング / 金ナノ粒子 / プラズモニクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本申請課題では，従来のナノポアなど電気的検出法による次世代DNAシーケンシング技術より高い信頼性を有する新規な技術として，分子識別能力に優れた表面増強ラマン分光（SERS：Surface Enhanced Raman Spectroscopy）によるDNAシーケンシングを提案し，その基盤技術の確立を目的とする。
申請者の有する金ナノ粒子二量体構造の巨大電磁場増強を用いた1分子感度SERS分析技術を基に，(1) DNA断片における1塩基検出感度および1塩基空間分解能を実現するとともに，(2) 巨大電磁場増強場におけるDNA断片の挙動を理解し，マニピュレーション技術（分子の検出部誘導・速度制御）の確立を行う。以上の基盤技術を基に，(3) SERSによるDNAシーケンシングの実現可能性を検証する。この研究により，メチル化など異常修飾を含めた塩基配列を識別可能なDNAシーケンシング技術が期待される。2019年度は以下の成果が得られた。
(1)単一金ナノ粒子二量体を用いてDNAオリゴマーのSERS計測を行った。ラマン増強度（検出感度）と検出確率向上のため，金ナノ粒子のサイズと粒子表面分子除去プロセス条件，溶液導入方法を最適化した。これらの最適化により，DNAオリゴマー導入前後のラマンスペクトル差分を取得することで大幅な検出確率向上を達成しシトシン検出試験を進めることができた。
(2)金ナノ粒子二量体配列に金電極をアライメントして作製することで新しいナノギャップ電極作製を行った。ナノトレンチへの粒子トラップ後に電子ビーム描画の高精度アライメントによって金ナノ配線を形成した。作製した電極の電気的評価（電圧電流特性）やSERS計測結果により，新しい手法によるナノギャップは巨大電磁場増強が可能な構造であると考えられる。この電極を用いることでDNA断片挙動の理解が可能になると期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度では以下の項目を明らかにすることを目的としてSERSおよび電気的手法によるDNAオリゴマー検出実験を行った。
(1)DNA断片における1塩基検出感度・1塩基空間分解能の実現と諸特性・現象の理解
単一金ナノ粒子二量体を用いてDNAオリゴマーのSERS計測を行った。ラマン増強度（検出感度）と検出確率向上のため，金ナノ粒子のサイズと粒子表面分子除去プロセス条件，溶液導入方法を最適化した。200 nmと100 nmの金ナノ粒子直径を比較し，200 nmのラマン強度と検出確率が高いことを明らかにした。さらに，粒子表面分子が障壁となり分子検出確率が低いことが問題となったが，分子除去のための紫外線オゾン処理の時間を変化させ最適な時間を導出した。また，溶液導入方法を工夫しDNAオリゴマー導入前後のラマンスペクトル差分を取得することで大幅な検出確率向上を達成した。この方法によりシトシンのラマンピークの取得を進めることが可能となった。
(2)巨大電磁場増強場におけるDNA断片挙動の理解とマニピュレーション技術の確立
金ナノ粒子二量体配列に金電極をアライメントして作製することで新しいナノギャップ電極作製を行った。それまではエレクトロマイグレーションやトップダウン加工でのナノギャップ作製であったが，加工の再現性が低くことと1 nm程度の微小なナノギャップ電極を作製することができない点が問題であった。ナノトレンチへの粒子トラップ後に電子ビーム描画の高精度アライメントによって金ナノ配線を形成した。作製した電極の電気的評価（電圧電流特性）やSERS計測結果により，新しい手法によるナノギャップは巨大電磁場増強が可能な構造であると考えられる。この電極を用いることでDNA断片挙動の理解が可能になると期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も引き続き項目(1)および(2)について研究を推進するとともに，(3)最適デバイス・手法を提案し，SERSによるDNAシーケンシングの実現可能性を明らかにする。
(1)DNA断片における1塩基検出感度・1塩基空間分解能の実現と諸特性・現象の理解：単一金ナノ粒子二量体を用いてメチル化を含めた様々な塩基・配列のDNAオリゴマーのSERS計測を行う。これまでに構築した最適作製条件，分析方法を適用し，DNAオリゴマー内に1つのみ1種類の塩基が含まれる配列にてSERS計測を行う。これにより，1分子感度の検出・同定が可能かを明らかにする。また，検出対象塩基の距離を変化させたオリゴマー（例えば，CCCACACCやCCACCACCなど）を用いることで1塩基空間分解能の検証を行う。
(2)巨大電磁場増強場におけるDNA断片挙動の理解とマニピュレーション技術（分子の検出部誘導・速度制御）の確立：作製した金ナノ粒子二量体ナノギャップ電極のギャップ制御および電気的なDNA分子挙動計測を行う。また，レイリー散乱光強度計測およびSERS計測による光学的1分子観察により，DNA分子挙動計測を行う。これらの手法によって，より詳細なDNA分子挙動の理解を進める。さらに分子動力学によりシミュレーションを進める。
(3)SERSによるDNAシーケンシングの実現可能性検証：最適デバイス・手法を提案し，SERSによるDNAシーケンシングの実現可能性を明らかにする。DNA断片をナノギャップ部に誘導したのち電気泳動により動かすことでDNA塩基配列をSERS計測により読む。ここで電気泳動電圧およびレーザ照射時間（誘電泳動力印可時間）がDNA断片の速度とラマンピークの時間変化に与える影響を明らかにするとともに，DNAシーケンシングの実現可能性を検証する。さらに，メチル化など異常修飾の検出を試みる。
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