2018 Fiscal Year Annual Research Report
NanoSuit膜の物性解明と生体微粒子電子顕微鏡観察法の確立
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18H01869
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
針山 孝彦 浜松医科大学, 光尖端医学教育研究センター, 特任教授 (30165039)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 浩司 浜松医科大学, 医学部, 教務員 (50345831)
平川 聡史 浜松医科大学, 光尖端医学教育研究センター, 特任准教授 (50419511)
高久 康春 浜松医科大学, 光尖端医学教育研究センター, 特任助教 (60378700)
河崎 秀陽 浜松医科大学, 光尖端医学教育研究センター, 准教授 (90397381)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 電子顕微鏡 / ナノ薄膜 / NanoSuit法 / 生体微粒子 / 表面科学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生物学をはじめとした生命科学の研究の基本として、「観る」ことは必要不可欠である。現在、高倍率にしたときに最大の分解能をもつ機器は電子顕微鏡であり、広く研究に用いられている。しかし、電子顕微鏡は電子線を試料に照射することで観察時の高分解能を得ているために、電子線の通過を邪魔する空気や水蒸気などを除くために、筐体内を高真空に維持しなければならない。その為、走査型電子顕微鏡では試料は事前に乾燥・金属蒸着処理が不可欠であると考えられ、電子顕微鏡の生物試料観察が始まった1950年代から70年におよぶ間、世界中でこの真空環境下に入れるための固定・乾燥・金属蒸着処理法の改良が重ねられてきた。
我々は、生きたまま・濡れたままの試料、つまり固定・乾燥処理などによる形態変化を生じさせないで試料を観察できれば、生命科学に大きく貢献できると考え研究開発を進めてきた。これまでに、生物個体と組織において、走査型電子顕微鏡技術を確立し、一部の細胞でも観察可能とした。本研究では、この技術の基本であるNanoSuit膜の表面界面物性を解析し、そのデータに基づいてNanoSuit膜溶液と重合法を改変し、すべての細胞および生体微粒子（ウイルスやエクソソームなど）を観察可能にすることを目的として研究推進してきた。その中で、NanoSuit膜溶液を塗布・成膜させる作業が短時間で達成できること、またNanoSuit膜が成膜されることで生物試料に導電性を付与できることが可能になったことは特筆に値する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに、生体試料に合わせた３種のNanoSuit膜溶液を調合し、生体試料に成膜できることを確認した。ヒト培養細胞（線維芽細胞など）にNanoSuit膜溶液を滴下し成膜させることで薄膜を形成させ生命維持できること、ヒト培養細胞にウィルスを播種し同時観察できることなどを確認した。また、生物試料が生得的にもつNanoSuit膜溶液に匹敵する化学物質をもつ場合、生きたまま無処理で電子顕微鏡観察できることを見つけた。
また、NanoSuit溶液を基板上に滴下しスピンコートした溶液状態のものにプラズマ照射することにより成膜させた膜において、プラズマ照射のエネルギーと照射時間によって厚みのコントロールが可能であることがわかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
NanoSuit膜の表面界面物性の解析Ⅰ
NanoSuit溶液の濃度による照射前の膜厚に対して、プラズマ照射のエネルギーと照射時間について解析を進める。また、生体の表面に存在する物質およびその疑似物質（生体適合性高分子）を生物試料又は基板上に塗布し、電子線又はプラズマ照射によりNanoSuit膜を形成させ、生物試料又は基板の特性変化の解析を行う。その為に、プラズマ照射のエネルギーと照射時間と膜厚の変化の測定とともに膜の重合度を推定し、かつ、特性変化の指標として生命維持に関する経時的評価を進める。
NanoSuit膜の表面界面物性の解析Ⅱ
NanoSuit法によって生物試料表面に生成させたナノ薄膜によって生命維持される仕組みの解明として、培養細胞および生物関連微粒子を用いて解析を進める。
ａ．ヒト線維芽細胞などにおけるNanoSuit膜による細胞の生命維持のメカニズム解明のため、生体自ら細胞外に分泌しているECS(Extra Cellular Substance)の特性と、人工的に塗布したNanoSuit膜との膜特性の比較を行う。
ｂ．ウイルスやエクソゾーム等の生体微粒子は、数nm程度のサイズである為にハンドリングが難しいが、器材界面のΖ電位を活用することでハンドリングを可能となった。その結果を踏まえ、マイクロジェット法あるいはマイクロ流路法などを用い、一定体積当たりの生体微粒子の総量を安定に換算できるようにする。その為に、微量液滴塗布環境の管理と、塗布後乾燥する際のコーヒーリングの形成制御を実施できるNanoSuit溶液を作成する。多様な生体適合性物質を調合し、広範に使える生体微粒子の観察法を確立する。
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