2018 Fiscal Year Annual Research Report
核酸アプタマー選抜系への粒子支援型キャピラリー電気泳動の導入と検証
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18H02002
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
吉本 敬太郎 東京大学, 大学院総合文化研究科, 准教授 (60392172)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
齋藤 伸吾 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (60343018)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | キャピラリー電気泳動 / 核酸アプタマー / DNA / RNA / 蛍光 / バイオセンサー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は現在までに可溶性タンパク質であるトロンビンを標的とし、MACE を分離・洗浄工程として導入した核酸アプタマー選抜（MACE-SELEX）に成功している。本研究課題では、MACE-SELEX を用いて低分子量化合物、中分子量化合物（短鎖ペプチド）、非可溶性膜タンパク質（プロテオリポソーム）を標的分子としてMACE-SELEX を実行し、各標的分子に対する核酸アプタマーを獲得することを目的としている。本年度は、本研究目的を遂行する過程で、以下の５つの研究成果が得られた。
【１】獲得した核酸アプタマーの高次構造解析（パラレル型Gカルテット構造の同定）を、従来法の放射性同位体標識を用いる手法を用いずに、分光学的手法のみで測定できる手法を考案した（Analyst, 143, 4022, 2018）。
【２】標的分子と結合すると大きな蛍光強度変化を示す蛍光修飾DNAアプタマーのスクリーニング法を確立した（Anal.Sci.,35,113, 2019）。
【３】蛍光性小分子に結合する RNA アプタマーの構造最適化に成功した。塩基変異を導入した三又構造が、RNAセンシングに有益な高次構造であることを明らかとした（RNA, 25, 590, 2019）。
【４】MACE-SELEXで獲得した DNA アプタマーを用いる血液凝固制御/中和アプタマーシステムを構築した。獲得したアプタマーとtoeholdを導入した中和剤配列を併用し、血液凝固抑制を迅速に解除・制御するアプタマーシステムを構築した（Mol. Ther. Nucleic Acids, 16, 348, 2019）。
【５】非天然型修飾核酸ライブラリーに対する MACE-SELEX に成功した。（Anal. Sci., 35, 585, 2019）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
各標的分子実験系において MACE separation が達成されるためには、標的分子のマイクロ粒子表面への適切な固定化法の選択、さらに使用するマイクロ粒子表面の化学的特性の理解が肝要となる。非結合性の核酸を極限まで排除し、核酸アプタマー/粒子複合体を初回ラウンドから高感度に検出・分取するためには、(1) 利用する粒子と分子固定化法の組み合わせの最適化、(2) 適切な表面化学修飾による粒子の分散安定化、(3) 標的分子の固定化密度の最適化、(4) MACE で最大の分離効率を達成できる電気泳動条件の最適化、などを調査・検討する必要がある。
今年度は、トロンビン、TNFa、低分子化合物などに対する MACE-SELEX、さらに非天然型ライブラリーへの検討を行い、様々な有益な知見が得られた。その成果として、５報の論文を報告することができたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
粒子として、表面に官能基やタンパク質が修飾された市販のマイクロ粒子に加え、リポソーム上に膜タンパク質を発現させたプロテオリポソームを利用する。この場合、創薬分野で非常に大きな注目を集めているGタンパク質共役型受容体に標的を設定し、獲得した細胞膜タンパク質に対する各種アプタマーを用いて内皮細胞の血管網形成阻害効果や幹細胞の分化制御など、細胞の生死や形質変化を制御・誘導する核酸アプタマーの獲得を併せて目指す。蛍光性分子、におい分子、麻薬分子などの低分子化合物に対する核酸アプタマーの獲得、また、RNAライブラリーの MACE-SELEX への適用、獲得したアプタマーのヌクレアーゼ耐性の付与、血中滞留性の付与のための各種アプローチを検討する。
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