Development of consolidated bioprocessing of macroalgae biomass to produce bioproducts

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18H02011
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 渥美 正太 北海道大学, 農学研究院, 教授 (00712275)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高須賀 太一 北海道大学, 農学研究院, 准教授 (70748409) ; 堀 千明 北海道大学, 工学研究院, 助教 (50722948)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 1,4-butanediol / icd欠損株 / 代謝工学 / 大腸菌

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、褐藻バイオマスを利用したバイオ化成品生産のための大腸菌作出を行っている。2020年度は、大腸菌TA1021株のicd遺伝子欠損株の作成および1,4-butanediol生産のための３種類の遺伝子、DEHU reductase (dehR)、5-keto-4-deoxy-D-glucarate dehydratase (KdgD)、および2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase (XylA)の３種類を保持するプラスミド（Midium copy plasmid）の作成を行った。ICD遺伝子欠損株については当初ゲノム編集技術によりICD遺伝子を欠損させる予定であったが、欠損を行うために設計した相同配列の長さが短かったため再度設計し、欠損を試みた。同時にP1ファージを用いた transductionを、DNA供与株JW1122（icd欠損）を用いて行ったところ、目的のicd遺伝子欠損株が作成できた。本欠損株については、シークエンスで確認予定である。プラスミド作成については、3種類のdehRと3種類のkdgD遺伝子および1種類のXylA遺伝子をタンデムにつないだプラスミド計9種の作成を行い、完成した。
褐藻バイオマスに含まれるアルギン酸を構成する単糖であるDEHUを大腸菌細胞内に取り込むための輸送タンパク質をコードした遺伝子3種類については、クローニング（こちらはLow copy plasmidを使用）を完了している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

現在まで、予定していた研究についてはおおむね推進できており、本研究はおおむね順調に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

2021年度は、作成したicd遺伝子欠損株に、クローニングで作成した9種類のプラスミド（3dehR x 3kdgD x 1 xylA）を形質転換し、2-ketoglutarateを効率よく生産できる遺伝子の組み合わせをグルコースを基質に生育実験を行い、吸光度測定（A600）で確認する。この実験から、9種類の組み合わせ遺伝子の中で最も高い生育が見られた組み合わせを決定する。次に、DEHUを基質に生育実験を行うため、DEHU輸送タンパク質をコードした3種類の遺伝子について、それぞれの遺伝子を持つプラスミドを、上記で決定した3種類の遺伝子形質転換する。