Development of consolidated bioprocessing of macroalgae biomass to produce bioproducts

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18H02011
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 渥美 正太 北海道大学, 農学研究院, 教授 (00712275)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高須賀 太一 北海道大学, 農学研究院, 准教授 (70748409) ; 堀 千明 北海道大学, 工学研究院, 助教 (50722948)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 1,4-butanediol / 褐藻 / 代謝工学

Outline of Annual Research Achievements

本研究では褐藻成分アルギン酸分解産物であるDEHU分子を細胞内に輸送し、1,4-butanediolを大腸菌細胞内で合成出来る変異株の作出を目的としている。これまでの研究において、DEHU分子輸送タンパク質遺伝子3種（low copy plasmid）、3種のDEHU reductase (dehR)と3種の5-keto-4-deoxy-D-glucarate dehydratase (KdgD)および1種の2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase（xylA）(midium copy plasmid)について遺伝子合成後、クローニングを行い、それらを大腸菌icd遺伝子欠損株に形質転換した。また、1,4-butanediol合成のための遺伝子2種2-keto acid decarboxylase（kdc）とalcohol dehydrogenase（adh）についても遺伝子合成およびクローニング後に、大腸菌icd遺伝子欠損株に形質転換済みである。後者のkdcとadh遺伝子については、2-ketoisovalarateを基質に、isobutanolが合成出来る事を確認済みであり、上記DEHU分子が調製でき次第、上記プラスミドの組み合わせ27種類について、試験予定である。DEHU分子については、精製アルギン酸を基質に、3種類のアルギン酸分解酵素を反応させ、DEHU分子を含むアルギン酸酵素加水分解産物を調製中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

DEHU分子のアルギン酸からの調製について、当初予定していたアルカリ処理法を試したが、HPLCによる加水分解産物解析を行ったところ、アルギン酸モノマーが非常に少ないことが分かった。そのため、酵素加水分解によるDEHU分子の抽出を行うに至った。酵素加水分解法では、アルギン酸分解酵素の調製が必要となり、遺伝子合成、クローニング、大腸菌による異種発現のための追加実験を要したため、やや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

今後は、アルギン酸の酵素による加水分解および、分解産物を用いた27種類の大腸菌株の生育実験を行う。生育が確認された株については、当該株に形質転換したプラスミドから、2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase（xylA）遺伝子を欠損させる事で、2,5-dioxopentanoateから2-ketoglutarateの経路を遮断し、kdcとadhによる、2,5-dioxopentanoateから1,4-butanediol合成経路を導入する予定である。