2018 Fiscal Year Annual Research Report
全４塩基遺伝暗号翻訳システムの開発と超多様化ペプチド創薬への応用
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18H02083
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| Research Institution | Japan Advanced Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
芳坂 貴弘 北陸先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (30263619)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 遺伝暗号 / 非天然アミノ酸 / 無細胞翻訳 / ペプチド / 分子進化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、申請者がこれまで研究を進めてきた４塩基への遺伝暗号拡張を発展させて、4塩基コドンのみからなる無細胞翻訳システムを構築し、さらにそれを遺伝情報連結型ペプチドセレクション技術と組み合わせることで、多様性を飛躍的に向上させたペプチドの取得技術に応用することを目的として実施している。30年度は、まずArg由来のコドンを4塩基コドンに拡張して、非天然アミノ酸を導入したペプチドを無細胞翻訳系で発現させて、その検出を行う一連の実験系の構築を進めた。その結果、開始コドンとHisタグ配列と4塩基コドンからなる遺伝子を用いて、4塩基コドンに対して蛍光標識非天然アミノ酸を導入することで、目的のペプチドを発現させてSDS-PAGEの蛍光イメージ測定により検出できることを確認した。また、通常の無細胞翻訳系を用いた場合は、Argによる3塩基としての翻訳が競合するために、限られた種類の4塩基コドンのみが翻訳されるに留まっていたが、アミノ酸を含まない再構成無細胞翻訳系を用いてMetとHisのみを添加した場合には、Argによる3塩基としての翻訳が回避されて、ほとんどの種類の4塩基コドンが効率良く翻訳されることも確認された。さらに、Hisタグに対する精製を行った後に質量分析を行うことで、目的ペプチドの検出が可能であることも確認できた。一方で、質量分析の結果から予想外の副生成物の生成も観察され、4塩基コドンの翻訳において、3塩基による天然アミノ酸への翻訳以外に、新たな競合過程の存在も示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Arg由来のコドンを4塩基コドンに拡張することで、多種類の4塩基コドンが効率良く翻訳可能であることを確認することができた。また、その実験を通じて、非天然アミノ酸導入ペプチドを再構成無細胞翻訳系で発現させて、迅速に検出する手法を確立でき、2年目以降の研究の基盤を確立することができた。一方で、実験方法の確立に比較的時間を要してしまい、初年度は学会等の外部発表には至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は継続して、すべての3塩基コドンについて4塩基コドンへの拡張を試み、独立に翻訳可能な4塩基コドンを網羅的に探索する。既に、Argのコドンについては、4塩基コドンへ拡張した場合に、Argを添加していない再構成無細胞翻訳系において効率良く4塩基コドンの翻訳が起こることを確認している。そこで他のコドンについても、対応するアミノ酸の添加・非添加による4塩基コドン翻訳の効率を確認する。また、非天然アミノ酸導入ペプチドの検出方法としては、SDS-PAGEの蛍光検出、および、Hisタグに対する精製を行った後の質量分析が有効であることが確認できたため、今後も同様の方法で行う。また、4塩基目の読み分けについて、1塩基ミスマッチを含む4塩基アンチコドンを持つtRNAを用いて翻訳を行うことで、互いに独立して翻訳可能か検証する。加えて、複数の4塩基コドンを並列させた遺伝子から、複数の非天然アミノ酸が導入されたペプチドの発現が可能かどうか検証して、4塩基コドンのみからなる翻訳の可能性を探る。
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