2019 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノム編集と化合物による細胞内在性タンパク質操作技術の開発
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18H02086
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| Research Institution | Nagoya Institute of Technology |
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Principal Investigator |
築地 真也 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (40359659)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 局在性リガンド / ゲノム編集 / 細胞内在性タンパク質 / タンパク質工学 / 光制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、申請者の独自技術である「局在性リガンドによるタンパク質局在制御技術（SLIPT）」と「ゲノム編集技術」を融合し、タグタンパク質をノックインした内在性タンパク質の局在を化合物（局在性リガンド）で制御する基盤技術を確立する。本年度は、下記の成果を達成した。
１）内在性cRafにループ改変型eDHFRタグをノックインした細胞の樹立。我々は前年度までに、標的タンパク質を細胞膜へ移行可能なツールとして、局在性リガンドmDcTMPとループ改変型eDHFRタグのペアからなるSLIPTシステムを開発した。また、CRISPR/Cas9による部位特異的ゲノム切断とゲノム修復機構を利用した遺伝子ノックイン系を立ち上げた。本年度は、ERKの上流因子であるcRafを標的とし、内在性cRafのC末端にin-frameで上述のループ改変型eDHFRタグをノックインした細胞の樹立に成功した。またその過程で、ノックイン細胞を得るためのさまざまなノウハウを確立した。
２）上記ノックイン細胞におけるcRaf活性化の実証。本年度はさらに、上で得たノックイン細胞に局在性リガンドmDcTMPを適用することで、ループ改変型eDHFRタグを融合した内在性cRafの局在移行と活性化を誘導できることを確認した。今後さらなる機能解析を進める。
３）光応答性局在性リガンドの開発。本年度はさらに、内在性タンパク質の局在を光で精密に時空間制御するための光応答性局在性リガンドを開発した。
今後これらの要素技術を統合することで、内在性タンパク質の局在とその下流プロセスを「化合物」や「光」によって制御可能な細胞内在性分子制御技術を構築する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、ループ改変型eDHFRタグを内在性cRafにノックインした細胞の樹立と、その動作確認まで達成した。さらに、内在性タンパク質の局在を光制御するための新規局在性リガンドの開発にも成功し、十分順調に進展していると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はまず、本年度までに確立したノックイン細胞と局在性リガンドを用いて、内在性cRafの制御と機能解析に取り組む。さらに、今回開発した要素技術を他のシグナルタンパク質にも適用し、内在性タンパク質の局在とその下流プロセスを「化合物」や「光」によって制御可能な細胞内在性分子制御技術（CRISPR-SLIPT技術）を構築する。
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[Journal Article] Engineering orthogonal, plasma membrane-specific SLIPT systems for multiplexed chemical control of signaling pathways in living single cells2020
Author(s)
Akinobu Nakamura, Choji Oki, Kenya Kato, Satoko Fujinuma, Gembu Maryu, Keiko Kuwata, Tatsuyuki Yoshii, Michiyuki Matsuda, Kazuhiro Aoki, Shinya Tsukiji
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Journal Title
ACS Chemical Biology
Volume: 15
Pages: 1004-1015
DOI
Peer Reviewed
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