2018 Fiscal Year Annual Research Report
膜タンパク質を搭載したエンベロープ型人工ウイルスの創製と細胞機能開拓
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18H02089
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
松浦 和則 鳥取大学, 工学研究科, 教授 (60283389)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐々木 善浩 京都大学, 工学研究科, 准教授 (90314541)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 人工ウイルスキャプシド / エンベロープ / 自己集合 / 膜タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
30年度は、以下の項目に関する研究成果を得た。
1) 静電相互作用によるエンベロープ型人工ウイルスキャプシドの創製
キャプシドの外側に配向するC末端側にGluを付与したbeta-annulus-EEペプチドの自己集合により、アニオン性の表面電荷を有する粒径60-80 nm程度の人工ウイルスキャプシドを構築した。これをカチオン性脂質(DOTAP)と両性イオン脂質(DOPC)で覆うことにより、静電相互作用を介したエンベロープ型人工ウイルスキャプシドの創製を検討した。電荷比1：1となるようにbeta-annulus-EEとDOTAP/DOPCを複合化したところ、粒径100 nm程度の球状集合体がDLS測定とTEM観察において確認された。混合脂質を被覆した人工ウイルスキャプシドのζ電位は、脂質で被覆していないものよりも正側に大きくシフトしたことから、複合化に成功したことが示唆された。さらに、興味深いことに、エンベロープ型人工ウイルスキャプシドの安定性の臨界会合濃度は0.25 uMであり、beta-annulus-EEペプチド単体の100倍低い濃度においても安定な構造体を形成していることを見出した。
2) エンベロープ型ウイルスキャプシドモデル細胞膜への膜タンパク質の装備
エンベロープ型人工ウイルスキャプシドへの膜タンパク質装備のため、まず、シリカやリン酸カルシウムをはじめとする単純化した微粒子をコアとし、この微粒子に脂質二分子膜を被覆したハイブリッドを作製した。このハイブリッドに対し、無細胞タンパク質発現系により膜タンパク質を直接その微粒子に組み込む手法を開発した。モデル膜タンパク質としては、インフルエンザ抗原であるヘマグルチニン、心筋細胞に多く発現し、細胞間の物質輸送チャネルとして働くコネキシン43を用い、その組み込み効率の定量を行うとともに、その最適化を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の目的通り、静電相互作用ならびにHis-tag/Ni-NTA相互作用を利用して、エンベロープ型人工ウイルスキャプシドを構築することに成功し、臨界会合濃度がペプチド単体の場合よりも低濃度となることを見出したため、概ね順調に進展していると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
エンベロープ型人工ウイルスキャプシドへの膜タンパク質の複合化を検討する。脂質二分子膜を有するエンベロープ型人工ウイルス キャプシドに導入する膜タンパク質として、膜型抗体やヘマグルチニンなどの膜受容体、Connexin-43やKcsAなどのチャネルタンパク質、カドヘリンなどの細胞接着タンパク質を用いる。これらのタンパク質に対応するT7プロモーター配列を有するcDNAを設計・購入し、PCRで増幅後、 エンベロープ型人工ウイルスキャプシドの存在下、再構築型の無細胞タンパク質合成系であるPURE systemにより発現させることで、エンベロープへの膜タンパク質の組込みを行う。さらに、キャプシド内部にDNAやmicroRNAを内包したエンベロープ型人工ウイルスの構築も行い、TEM観察や蛍光相関分光(FCS)法による内包の確認を行う。
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