2019 Fiscal Year Annual Research Report

Mechanistic Enzymology of Radical SAM Enzymes in Natural Product Biosynthesis

Research Project

Project/Area Number	18H02095
Research Institution	Tokyo Institute of Technology
Principal Investigator	江口正東京工業大学, 理学院, 教授 (60201365)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2022-03-31
Keywords	ラジカルSAM酵素 / 天然物 / 生合成 / 反応機構
Outline of Annual Research Achievements	本年度は、ホパノイドの側鎖の生合成初期段階の炭素鎖伸長反応に関わると推定されていたラジカルSAM酵素HpnHの機能解析を行った。これまでHpnHがジプロプテンをアデノシルホパンに変換すると推定されていたが、実体は不明であった。そこで、スクアレン-ホペン環化酵素とHpnHを共発現させた大腸菌の無細胞抽出液を用いて反応系中にてスクアレンをジプロプテンに変換し、HpnHと反応させた。その結果、アデノシルホパンが形成されることが明らかとなり、生成物を反応系から単離し構造解析を行ったところ、生成物は (22R)-アデノシルホパンであることが明らかになり、解析に用いたHpnHが立体選択的な炭素鎖伸長反応を触媒することを示す結果である。次に、大腸菌にて異種発現させたHpnHを嫌気条件にて精製し、ジプロプテンをスクアレンに溶かし、高濃度の界面活性剤存在下で混合することでHpnHと反応させた。その結果、アデノシルホパンが検出され、これによって、HpnHがジプロプテンのC29位と5’-デオキシアデノシンのC5’位の間に新たな炭素-炭素結合を形成する反応を触媒するということを明らかにすることができた。また、本反応を重水中で行ったところ、HpnHによる触媒反応によって水由来の水素原子がC22位に取り込まれることが明らかになった。以上の結果、HpnHが触媒する立体選択的な炭素-炭素結合形成反応の機構を次のように推定した。SAMの還元的開裂によって生じた5’-デオキシアデノシルラジカルがジプロプテンの末端の二重結合にラジカル付加することで、ラジカル中間体が形成される。このラジカル中間体がHpnH活性中心において水とのプロトン交換可能な残基から立体選択的に水素原子を引き抜くことで、(22R)-アデノシルホパンが形成されると考えられ、ラジカル停止に関わる残基はCysまたはTyrであると推測している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度は、ホパノイドの側鎖の生合成初期段階の炭素鎖伸長反応に関わると推定されていたラジカルSAM酵素HpnHの機能解析を行った。まず放線菌由来のHpnHの大腸菌での異種発現に成功し、スクアレン-ホペン環化酵素とHpnHを共発現させた大腸菌の無細胞抽出液を用いて、反応系中にてスクアレンをジプロプテンに変換し、HpnHと反応させところ、アデノシルホパンが形成されることが明らかとなった。さらに、生成物を反応系から単離し構造解析を行ったところ、生成物は (22R)-アデノシルホパンであることが明らかとした。また、ジプロプテンをHpnHとin vitroで反応させたところ、アデノシルホパンが検出され、これによって、HpnHがジプロプテンのC29位と5’-デオキシアデノシンのC5’位の間に新たな炭素-炭素結合を形成する反応を触媒するということを明らかにすることができた。また、重水中での実験により、水由来の水素原子がC22位に取り込まれることも明らかとした。この様に、着々と新たな知見が得られている段階にあり、これらを考えるとほぼ予定通りに研究計画が進んでいると考えられる。
Strategy for Future Research Activity	来年度以降も引き続き、機能未知のラジカルSAM酵素の機能解析を進めていく。種々の天然物の生合成遺伝子クラスターにコードされているラジカルSAM酵素には、バクテリオホパン、マクロラクタム抗生物質インセドニン、アミノグリコシド抗生物質デオキシブチロシンおよびトブラマイシン、抗腫瘍抗生物質パクタマシンなどの生合成遺伝子クラスターに含まれるラジカルSAM酵素があり、これらの酵素の機能は、化学構造と類似の抗生物質の生合成経路等から推定できるものの、詳細な反応機構は、何が基質であるかを含めて未解明であり、非常に興味深いものである。本研究では、着々と機能未知のラジカルSAM酵素機能解明を進めており、今後も精力的に進めていく所存である。