2019 Fiscal Year Annual Research Report
Studies on the molecular basis of incompatibility for creating the variety of industrial abilities in Koji mold Aspergillus oryzae
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18H02123
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
丸山 潤一 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任准教授 (00431833)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北垣 浩志 佐賀大学, 農学部, 教授 (70372208)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 麹菌 / 不和合性 / ゲノム編集 / 細胞融合 / 糸状菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
糸状菌においては、遺伝的に不適合である株間で細胞融合体が死に至るまたは十分な生育ができない「不和合性」という現象が存在する。研究代表者らはこれまでに、有性世代が発見されていない麹菌において交配育種法を開発する過程で、多くの株の組み合わせが不和合性であることを初めて発見した。これは、麹菌の交配育種による形質多様性の創出が困難であることを意味している。
本研究では、比較ゲノム解析により株間の配列多型を見いだして、不和合性の自己・非自己認識機構を明らかにする。さらに、ゲノム編集技術を利用した効率的な遺伝子操作により、不和合性に関与する遺伝子を探索・同定する。麹菌の形質多様性の創出を可能とする交配育種法の確立を目指し、これを阻む不和合性を制御する機構の分子基盤の解明を目的とする。
2018年度は、互いに不和合な2つの麹菌株をモデルとして、配列多型から不和合性に関与する遺伝子の候補を抽出したが、現在までに不和合性への関与を見いだすことができていない。そこで2019年度は、より多くの麹菌株を対象として、和合性グループを分類することによって、不和合性を制御する因子を抽出する方針に転換した。ゲノム配列の情報から分類されている系統すべてを網羅するように、34株を選んで栄養要求性の相補による不和合性の解析を行い、和合性グループ分類を行った。その結果、株系統が麹菌の和合性グループと一致し、異なる系統の株間では不和合性であることを明らかにした。2020年度は和合性グループの情報を利用して、不和合性に関与する遺伝子の同定を試みる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
麹菌では食品醸造をはじめ様々な用途に多くの実用株が用いられており、これまでに研究代表者らは麹菌実用株において不和合となる株の組み合わせが存在することを初めて発見した。
2018年度は、互いに不和合な2つの麹菌株をモデルとして、配列多型から不和合性に関与する遺伝子の候補を抽出したが、現在までに不和合性への関与を見いだすことができていない。そこで2019年度は、より多くの麹菌株を対象として、和合性グループを分類することによって、不和合性を制御する因子を抽出する方針に転換した。ゲノム配列の情報から分類されている系統すべてを網羅するように、34株を選んで栄養要求性の相補による不和合性の解析を行い、和合性グループ分類を行った。
ゲノム編集技術CRISPR/Cas9システムを利用して、ウリジン/ウラシル栄養要求性を付与するpyrGおよびpyrFの2種類の遺伝子破壊株を、すべての株から取得した。異なる栄養要求性株どうしで融合させ、栄養要求性の相補によるウリジン/ウラシルを含まない最少培地での生育の有無を指標に不和合性を判定した。その結果、同じ系統に属する株どうしを融合させた場合には、最少培地での生育がみとめられ、一方で、異なる系統どうしの株では栄養要求性の相補が見られなかった。
以上の結果から、株系統が麹菌の和合性グループと一致し、異なる系統の株間では不和合性であることを明らかにすることができた。これは、多様な用途に用いられる麹菌株の不和合性を全体的に解明した初めての成果であり、今後の交配育種による機能開発に有用な情報を与える。よって、本研究は順調に進展しており、次年度に和合性グループの情報を利用した不和合性に関与する遺伝子の同定が可能になることが期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度は、比較ゲノム解析によって、麹菌株間の不和合性決定に関与する遺伝子の探索を行う。前年度までに、34個の麹菌株を対象として、栄養要求性の相補による不和合性の解析を行い、和合性グループは株の系統と一致し、異なる系統の株間では不和合性であることを明らかにした。2020年度は、次世代シーケンサーによって各麹菌株の全ゲノム配列を解読し、不和合性の組み合わせの株間で配列多型な候補遺伝子の抽出を行う。得られた候補遺伝子について、ゲノム編集技術CRISPR/Cas9システムを利用して、不和合性の組み合わせの麹菌株両方で破壊する。栄養要求性の相補による最少培地での生育を調べることで、不和合性が解除されるかどうかを解析する。
一方で、ゲノム編集技術によるランダム変異導入を利用した、不和合性制御遺伝子の解明も試みる。CRISPR/Cas9システムによる高効率変異導入技術を利用して、全遺伝子を標的とした変異導入スクリーニングを行う。2019年度は、麹菌が有する約12,000 個の全遺伝子配列に対し、CRISPR/Cas9システムの標的となる20塩基をデザインした。2020年度はこのデザインに基づき、ゲノム編集を利用した麹菌の全遺伝子変異導入ライブラリーを作製して、不和合性の株の組み合わせのプロトプラスト融合と同時に導入させる。この際、高効率の変異導入が可能なCRISPR/Cas9システムによって、細胞融合体の両株に由来する核の同一の遺伝子に同時に変異導入することができる。そして、不和合性が解消され栄養要求性の相補によって最少培地で生育した細胞融合体を単離する。得られた細胞融合体から変異が生じた遺伝子を特定することで、不和合性に関与する遺伝子の同定を試みる。
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Research Products
(19 results)
