2019 Fiscal Year Annual Research Report
Development of an in vitro co-culture system for elucidation of host-gut microbiota symbiotsis
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18H02126
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
片山 高嶺 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (70346104)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 紀彦 京都大学, 生命科学研究科, 助教 (40724612)
神戸 大朋 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (90303875)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 共培養 / 腸上皮細胞 / 嫌気性細菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腸上皮細胞株Caco-2をカルチャーインサート上で単層化させた後、頂端膜側を完全に嫌気性環境としつつ基底膜側を好気条件とする培養装置の開発に成功した。すなわち、頂端膜側は溶存酸素濃度が0.5%以下、かつ基底膜側の溶存酸素濃度が60%以上の状態を７日間維持することに成功した（以降、アピカル嫌気培養とする）。通常の二酸化炭素チャンバー内で好気培養を行ったCaco-2細胞、および頂端側と基底膜側の両側を完全嫌気とした嫌気培養を行ったCaco-2細胞と比較したところ、アピカル嫌気培養では好気培養と同程度のタイトジャンクションが形成されており（クローディン２およびクローディン４を免疫染色）、また細胞の損傷（培養上清の乳酸デヒドロゲナーゼ活性を測定）も見られなかった。一方で、嫌気培養を行った場合は、タイトジャンクションの崩壊および細胞損傷が観察された。トランスクリプトーム解析の結果、アピカル嫌気培養においては一部の遺伝子発現の上昇が見られ、メタボローム解析においてもアピカル嫌気培養によって一部の化合物が培養上清に多く存在していることが明らかとなった。次に、１０種程度の絶対嫌気性細菌をアピカル側培地に投入して共培養を行ったところ、８種の細菌において、共培養しなかった場合と比べて大幅な生育促進（100倍から10000倍程度）が観察された。共培養後のビフィズス菌についてトランスクリプトーム解析を行った結果、細胞表層形成に関連する遺伝子の発現が大幅に増加していた。以上のことから、腸管上皮細胞と偏性嫌気性細菌の共培養が可能な装置の開発に成功した。クロストークの分子機序解明に役立つと期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
腸管上皮細胞と偏性嫌気性細菌の共培養を行い、そのクロストークをオミクス解析で分析可能であることを示したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
２０２０年度は、共培養時の培養上清をメタボローム解析する。細菌代謝物のうち宿主細胞のレセプターリガンドとなる化合物に着目して、共培養のクロストークを分子レベルで解明する。特に脂質代謝物や芳香族アミノ酸代謝物に着目しており、GPRやAhRリガンドとして機能する物質を候補とする。これら候補化合物の産生を担う細菌遺伝子を同定して機能解析や構造解析を行うと共に、遺伝子破壊株を作製する。作製した遺伝子破壊株を上皮細胞と共培養し、野生型を共培養した際と比較オミクス解析を行い、当該代謝物が上皮細胞に与える影響を解析する。一方、２０１９年度の結果より、ビフィズス菌と上皮細胞の共培養においてビフィズス菌の細胞表層形成に関わる遺伝子が上昇していることが明らかとなっている。この遺伝子の破壊株も作成して、同様の実験（上皮細胞に与える影響）を行う。これらの結果を統合して、腸内細菌ー宿主間のクロストークを明らかとする。
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